牛膝和白芍配伍对帕金森病肝阳上亢证小鼠的 协同神经保护作用及机制研究

张静艳，郭科东，金明，荣华，张晓杰（1.黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨 150000；.齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000；3.黑龙江护理高等专科学校，哈尔滨 150000）

关健词：帕金森病；肝阳上亢证；牛膝；白芍；氧化应激；核因子NF-E2相关因子2；血红素氧合酶1

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中老年人群常见的椎体外系神经退行性疾病，以静止性震颤、姿势异常、行动障碍为主要临床表现，严重者会造成情绪、记忆及认知功能障碍。中脑黑质致密部大量多巴胺（dopamine，DA）能神经元进行性丢失及路易小体异常聚集为其典型的病理表现[1]。PD患者脑组织抗氧化酶活性显著减少，脂质过氧化水平异常增加[2]，而活性氧形成过量和DA能神经元功能障碍及死亡密切相关[3]。目前，寻找具有抗氧化能力及神经保护作用的药物已经成为PD治疗的重要方向[4]。

镇肝熄风汤为《医学衷中参西录》的经典方剂，具有良好的抗氧化作用，在肝阳上亢型PD的治疗实践中已经取得显著疗效[5-6]。然而大复方由于成分众多，药味间作用关系复杂，药物配伍在复方中的真实作用难以准确反映。牛膝与白芍是镇肝熄风汤的核心药对，是治疗PD方剂中出现频率较高的药对，课题组前期体外实验已经证实，牛膝与白芍有效组分配伍对DA能神经元具有协同增效的神经保护作用[7]，但其配伍的体内实验及抗PD的具体机制鲜有研究。本研究采用中医特色明显的病证结合动物模型，通过行为学实验、生化检测及分子生物学等方面探讨牛膝和白芍配伍对PD肝阳上亢证小鼠氧化应激反应的调节机制，为临床中药复方的二次开发及应用提供实验基础。

1 材料

1.1 动物

SPF级8周龄健康C57BL/6雄性小鼠90只，体质量（20±2）g [辽宁长生生物技术股份有限公司，动物许可证号：SCXK（辽）2020-0001]。饲养条件：室温25℃，湿度40%～50%。

1.2 试药与仪器

附子（湖北金贵中药产业有限公司，批号：D4120201）；牛膝、白芍（北京同仁堂有限公司，批号：801000130、801001062），分别取附子、牛膝、白芍及牛膝白芍配伍组4组饮片按传统煎药法制成含附子、牛膝、白芍及牛膝白芍配伍组（生药量分别为0.2、0.33、0.17、0.5 g·mL－1）水煎液。镇肝熄风汤（齐齐哈尔医药商厦，相当于生药量为1.67 g·mL－1，经齐齐哈尔医学院药物研究所鉴定专家进行鉴定）；1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP，美国Sigma公司，批号：M0896）；兔抗鼠酪氨酸羟化酶（TH，批号：58844S）、Lamin B抗体（批号：13435S）（CST公司）；兔抗鼠核因子NF-E2相关因子2（Nrf2）、血红素氧合酶1（HO-1）抗体（Abcam公司，批号：ab137550、ab189491）；谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：A003-4-1、A001-3-2、A006-1-1）。全自动凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；SA102转棒式动物疲劳测试仪（江苏赛昂科技有限公司）。

2 方法

2.1 模型建立与给药

小鼠随机分为对照组、模型组、镇肝熄风汤组、牛膝组、白芍组及牛膝白芍配伍组，每组15只。除对照组外，各组给予附子汤（3 g·kg－1）灌胃4周制备肝阳上亢证动物模型[5]。附子灌胃结束后，牛膝、白芍及牛膝白芍配伍组分别按4.5、2.3、6.8 g·kg－1灌胃给予相应药物水煎液，镇肝熄风汤组给予镇肝熄风汤（25 g·kg－1），1次·d－1，连续灌胃给药14 d。于给药第10日开始，灌胃给药前1 h，模型组及各给药组小鼠连续5 d腹腔注射MPTP（30 mg·kg－1）制备PD肝阳上亢病症结合小鼠模型[8]。造模结束后以小鼠出现易激惹、竖毛、弓背、震颤、抽搐等症状即视为模型建立成功[9]。本次模型制备全部成功。

2.2 小鼠易激惹程度的评定

易激惹程度分为3级：Ⅰ级为小鼠头颈部被捉持时立即表现出尖叫、惊跳等症状；Ⅱ级为小鼠头颈部被捉持时表现出攻击行为；Ⅲ级为小鼠尾部被提起时即表现出尖叫、惊跳或攻击行为。Ⅰ～Ⅲ级均不出现者为0级，实验结束前测量1次[10]。

2.3 行为学检测

2.3.1 旷场实验 实验前适应环境1 h。实验时将小鼠放于旷场箱（50 cm×50 cm）中央，采用旷场实验分析系统记录小鼠运动总路程，测试时间为5 min[11]。

2.3.2 转棒实验 实验前对小鼠进行预先训练，转速30 r·min－1，训练时间为3 min，连续训练2 d。实验时以0.12 r·min－1的加速度从4 r·min－1开始恒定加速，最大转速为40 r·min－1，记录小鼠在5 min内，在转棒上停留的时间，即转棒掉落潜伏期[12]。

2.4 免疫组化法分析TH阳性神经元平均光密度

黑质区取材进行石蜡包埋切片，脱蜡，抗原修复，3%H2O2封闭。PBS漂洗后滴加兔抗TH多克隆抗体（1∶200），室温孵育。PBS漂洗后滴加羊抗兔二抗孵育1 h。DAB工作液显色，苏木素复染，PBS充分冲洗返蓝并封片。在显微镜下观察黑质中TH表达阳性的神经元并拍片，根据Image-Pro Plus 6.0软件计算各组平均光密度。

2.5 氧化应激指标测定

于冰上取适量小鼠脑黑质，加入9倍预冷的生理盐水制备10%组织匀浆，离心（2500 r·min－1，15 min）后取上清液，按照试剂盒说明采用生物化学法测定GSH与MDA的表达水平及SOD的活性。

2.6 Western blot检测相关蛋白表达

冰上取脑组织剪碎，加入蛋白酶抑制剂及裂解液震荡混匀，以12 000 r·min－1离心10 min，取上清液即为所提蛋白溶液。另取脑黑质按照核蛋白抽提试剂盒说明书抽提核蛋白，均采用BCA法进行蛋白定量。SDS凝胶电泳分离蛋白，转膜、封闭。分别加入一抗Nrf2（1∶1000）、HO-1（1∶1000）、β-actin（1∶500）及Lamin B（1∶1000），于4℃孵育过夜，二抗（1∶6000）孵育，TBST缓冲液洗膜。ECL化学发光法显影后，采用AlphaEase FC图像分析软件对免疫印迹条带进行分析。

2.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD方法，等级资料采用Ridit分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 牛膝白芍配伍对小鼠易激惹程度的影响

与对照组相比，模型组小鼠易激惹程度明显增加；与模型组相比，镇肝熄风汤组、牛膝组、白芍组及配伍组均可不同程度改善小鼠的易激惹程度（见表1）。

表1 各组小鼠易激惹程度的比较(n＝15) Tab 1 Irritation degree of the mice in each group (n＝15)

3.2 牛膝白芍配伍对小鼠行为学的影响

与对照组相比，模型组小鼠旷场运动总距离明显减少、转棒掉落潜伏期明显缩短；与模型组相比，各给药组均可不同程度增加小鼠旷场运动总距离、延长转棒掉落潜伏期；配伍组作用明显优于牛膝和白芍单独用药组；配伍组与镇肝熄风汤组相比，差异无统计学意义（见图1及图2）。

图1 各组小鼠旷场实验运动轨迹Fig 1 Movement trajectory of the mice in each group in the open field experiment

图2 各组小鼠行为学比较（±s，n＝15）Fig 2 Behavioral comparison of mice in each group（±s，n＝15）

3.3 牛膝白芍配伍对小鼠神经细胞TH阳性表达比较

与对照组相比，模型组黑质TH阳性表达明显减少；与模型组相比，各给药组可不同程度增加TH阳性表达水平；与牛膝、白芍单独用药组相比，配伍组TH阳性表达增加更为明显；配伍组与镇肝熄风汤组相比，差异无统计学意义（见图3）。

图3 各组小鼠黑质神经细胞TH阳性表达的比较（±s，n＝5）Fig 3 Positive expression of TH in the substantia nigra of the mice in each group（±s，n＝5）

3.4 牛膝白芍配伍对小鼠脑组织氧化应激指标的影响

与对照组相比，模型组小鼠脑黑质抗氧化物质SOD活性、GSH水平明显降低，氧化物质MDA水平明显增高；与模型组相比，镇肝熄风汤组、牛膝组及配伍组可不同程度逆转SOD活性、GSH及MDA的水平，而白芍组对改善氧化应激作用不明显；配伍组改善氧化应激效应明显优于牛膝、白芍单独用药组；配伍组与镇肝熄风汤组相比，差异无统计学意义（见图4）。

图4 各组小鼠脑组织氧化应激指标的比较（±s，n＝6）Fig 4 Oxidative stress index of the mice in each group（±s，n＝6）

3.5 牛膝白芍配伍对小鼠脑组织Nrf2、HO-1蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组黑质核Nrf2蛋白、浆HO-1蛋白表达水平未见明显差异；与模型组相比，镇肝熄风汤组、牛膝组及配伍组核Nrf2、浆HO-1蛋白表达量均明显增加，而白芍组蛋白表达虽有增加趋势，但差异无统计学意义；配伍组蛋白表达明显优于牛膝、白芍单独用药组；配伍组与镇肝熄风汤组相比，差异无统计学意义（见图5）。

图5 小鼠脑组织Nrf2、HO-1蛋白表达比较（±s，n＝5）Fig 5 Nrf2 and HO-1 protein expression in the brain tissue of mice（±s，n＝5）

4 讨论

随着社会人口老龄化趋势的逐年加重，PD的发病率日益增加，如何对该疾病进行有效治疗已成为医药界研究的重点课题[13]。西医治疗PD不良反应明显，长期持续治疗药效减退，且不能阻止病情的进展[14]。肝肾阴虚、肝阳上亢是PD的核心中医病机，临床研究报道了镇肝熄风汤对PD肝阳上亢证的防治，疗效确切[15]。然而中药大复方药味繁多，药对的具体作用难以在方剂中研究与确定。牛膝白芍是镇肝熄风汤的核心配伍药对，牛膝补益肝肾、引火下行，具有明显的抗氧化、调节免疫作用[16-17]；白芍养血濡筋、缓急止痉，具有神经保护、镇痛抗炎作用[18]。前期体外实验表明，牛膝和白芍的主要有效成分能抑制鱼腾酮诱导的PC12细胞凋亡，有效成分配伍后作用增强[7]。基于“组分配伍研制现代中药”的理念，本课题组提取镇肝熄风汤的君药牛膝和臣药白芍为核心配伍药对，探讨两者配伍对DA能神经元是否具有协同神经保护作用及具体作用机制。

附子辛燥大热，久服耗伤阴血，附子灌胃可制备肝阳上亢证动物模型，使动物出现烦躁、易怒（易激惹）症状[5，10]；MPTP是啮齿及灵长类PD研究中使用最多的外源性神经毒素，可选择性损伤DA能神经元并诱导PD的发生发展[19]。研究表明，由MPTP复制的PD模型小鼠的运动功能明显异常且DA能神经元数量显著减少[20]。TH是催化DA、肾上腺素等神经递质合成的限速酶[21]，常用于验证PD模型是否构建成功，细胞表达TH是判断DA能神经元数目的黄金标准[22]。本实验结果表明，以附子灌胃联合腹腔注射MPTP制备的PD肝阳上亢证小鼠模型，其激惹程度明显增加，旷场运动总距离明显减少，转棒掉落潜伏期明显缩短，TH阳性表达减少，人类肝阳上亢型PD的行为特征及病理特点在本实验小鼠模型中得到了较好的模拟。本研究发现，各给药组可不同程度降低小鼠激惹程度，增加旷场运动总距离，延长转棒掉落潜伏期，减少TH阳性神经元的丢失，说明牛膝、白芍及两者配伍均可有效改善小鼠肝阳上亢症状及运动功能障碍，减少DA能神经元损伤，并且配伍组比单独用药组的治疗效果更为显著。

PD的发生与氧化应激密切相关[22]，研究表明神经毒素MPTP会使神经元产生大量氧自由基而诱发氧化应激[23]。氧自由基使神经元膜结构被氧化，产生大量MDA，使得DA能神经元变性及缺失[24]，因此MDA可间接反映组织氧化损伤的水平[25]。为应对过度氧化，机体在氧化应激刺激下产生抗氧化物SOD及GSH。SOD可抑制氧自由基生成[23]，GSH对氧化应激产物进行还原[27]，SOD及GSH水平体现机体对抗氧化损伤的能力[28]。为检测小鼠脑内氧化应激的损伤程度，本课题组检测了氧化与抗氧化反应的标志物。结果发现，模型组小鼠黑质MDA含量明显增高，SOD及GSH水平明显降低，说明模型组小鼠脑内氧化应激损伤明显。而经药物治疗后，牛膝组及配伍组小鼠脑内氧化应激反应出现不同程度的改善，且配伍组改善氧化应激的效果较优。

Nrf2是诱导机体产生抗氧化酶以对抗氧化应激的重要因子[29]。在细胞发生氧化应激或受内源性、外源性反应性物质如H2O2、超氧化物攻击时，生理条件下位于细胞质中非活性状态的Nrf2蛋白被激活，与其结合蛋白发生解离，转位至细胞核，诱导SOD、GSH的表达，减少脂质过氧化物MDA生成，并启动下游抗氧化酶HO-1的转录[30-31]。研究发现，HO-1能保护器官免受氧化应激[32]，其表达减少与PD等年龄依赖性疾病的发病机制有关[33]。本研究表明，牛膝组及配伍组均可促进神经细胞Nrf2的核内表达并诱导其下游产物HO-1转录增加，改善脑内的氧化应激状态，其中配伍组效应最强，其作用与镇肝熄风汤相当，而白芍组对PD肝阳上亢证小鼠虽有抗氧化趋势，但作用不明显。本实验结果说明，牛膝与白芍虽对PD肝阳上亢证小鼠均具有神经保护作用，但两者在抗氧化及相关靶通路发挥的作用仍存在差异，白芍在两者配伍中发挥的作用将另文报道，牛膝白芍配伍发挥抗氧化作用的机制与牛膝的抗氧化功能相关，两药配伍后发挥协同增效的神经保护作用。

综上，牛膝白芍配伍可有效改善PD肝阳上亢证小鼠的易激惹程度及行为障碍，保护DA能神经元，两药配伍具有协同作用，其机制可能是通过牛膝激活Nrf2/HO-1信号转导通路发挥抗氧化作用。本实验证明牛膝白芍两药配伍在治疗PD肝阳上亢证方面存在相使作用，虽然其治疗机制有待进一步研究，但是本实验为中药配伍“相使增效”的科学理论及中药大复方的二次优化升级提供了更多实验依据。