蜂针蜇刺疗法的镇痛抗炎作用及对类风湿大鼠脾脏组织切片的改变

倪珊，刘彦含，王瑛，杨萌萌

(黑龙江省森工总医院，黑龙江 哈尔滨 150000)

蜂针蜇刺治疗简称蜂疗，是以镊子夹持蜜蜂，利用蜜蜂蜂针为工具，在中医针灸理论的指导下，循经络皮部和穴位施行不同手法的针刺，将蜂毒的药理作用与穴位的治疗作用相结以防治疾病的方法称为蜂针疗法[1]。《黄帝内经》记载：“蜂螯有毒可疗疾”，在方以智《物理小识》卷五中，记述将蜂针制作“药蜂针”的方法：“取黄蜂之尾针合硫炼，加水麝为药。置疮汤头，以火点而灸之。”蜂毒最早收录于《吉林中草药》：“蜂毒，祛风湿，治风湿性关节炎。”近年来，随着中医学的不断发展和政策的支持，不断有临床医师在临床上应用蜂疗来治疗类风湿性关节炎[2-5]。本研究以动物实验为基础，进一步阐述蜂疗对类风湿性关节炎的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明小鼠，SPF级，周龄7周左右，体质量18～20 g，购自于黑龙江中医药大学动物实验中心，动物使用许可证号：SCXK(黑)2018-003，饲养环境温湿度：室温18～22 ℃，相对湿度为50%～60%，适应性喂养1周。

SD大鼠，SPF级，周龄8周左右，体质量200～220 g，购自于黑龙江中医药大学动物实验中心，动物使用许可证号：SCXK(黑)2018-003，饲养环境温湿度：室温18～22℃，相对湿度为50%～60%，适应性喂养1周。

1.2 主要仪器及试剂

弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂(Sigma公司，批号：SLBQ2284V、SLBK1731V)；牛Ⅱ型胶原液(Chondrex公司，批号：190514)；醋酸(阿拉丁试剂上海有限公司)；二甲苯(阿拉丁试剂上海有限公司)；无水乙醇(中国国药)；苏木精(中国Solarbio)；曙红Y-醇溶(中国sangon)；洛索洛芬钠(第一三共制药上海有限公司，批号：20191201)；分析天平；石蜡切片机(德国Leica)；电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏)；超纯水系统(香港Heal Force)；显微镜型号(日本OLUMPUS)；显微镜拍照系统(日本OLUMPUS)，MIKRO 200R离心机(德国Hettich公司)。

1.3 实验分组及给药

1.3.1 镇痛实验

醋酸致小鼠扭体实验:雄性小鼠50只。禁食不禁水过夜。随机分为5组(每组10只)：蜂针蜇刺30 s组、蜂针蜇刺1 min组、蜂针蜇刺5 min组、阳性对照药组(洛索洛芬钠组，0.025 g/kg)和空白组(等体积溶剂)。给药30 min后，0.8%的醋酸生理盐水溶液，沿腹膜壁缓慢注入腹腔。记录20 min内，小鼠扭体次数。

1.3.2 抗炎实验

二甲苯致耳肿胀实验:小鼠50只，雌雄各半。禁食不禁水过夜。随机分为5组(每组雌雄各5只，共10只)：蜂针蜇刺30 s组、蜂针蜇刺1 min组、蜂针蜇刺5 min组、阳性对照药组(洛索洛芬钠组，0.025 g/kg)和空白组(等体积溶剂)。给药30 min后，在小鼠右耳正反面涂抹二甲苯20 μL。2.5 h后，处死小鼠，8 mm打孔器，打下小鼠左右耳，分析天平称取重量,计算左右耳重量差值。

1.3.3 类风湿实验

雄性SD大鼠60只，按体质量随机分为空白组、模型组、阳性对照药组(洛索洛芬钠组，0.009 g/kg)、蜂针(蜜蜂来源：意大利蜂，由黑龙江省森工总医院蜂疗室提供)治疗组(5 min，1 min，30 s)，每组10只。二次免疫时开始治疗，空白对照组和模型组大鼠灌胃给与等体积蒸馏水。蜂针治疗组取足三里、血海、肾俞、肝俞、脾俞穴，以75%酒精消毒所取得穴位，用镊子轻轻捏住蜜蜂的腰部，对其尾部对准穴位，让其自然蛰入穴位并留针(30 s、1 min、5 min) 后，将毒刺拔除，每只活蜂只蛰1个穴位。蜂针治疗每天1次，每次1针，每次治疗取一个穴位，以上穴位轮流交替，共治疗35 d。

1.4 造模方法

在冰水浴条件下，向含弗氏完全佐剂中离心管中缓慢滴加等体积的牛Ⅱ型胶原液(2 mg/mL)，用电动匀浆器匀浆制备成乳浊液(含胶原1 mg/mL)。造模大鼠在尾根基部3个不同部位皮内注射等体积的胶原乳浊液200 μL/只，进行初次免疫。6 d后，同样方法注射弗氏不完全佐剂乳浊液，进行二次免疫，100 μL/只。二次免疫后，足部肿胀的大鼠即为类风湿(CIA)模型成功大鼠。

1.5 观察指标及检测方法

镇痛实验观察小鼠扭体次数，计算扭体次数。抗炎实验称量小鼠左右耳重量，计算重量差。类风湿实验，分别在治疗15 d和35 d测量大鼠的足肿胀体积，治疗35 d后，禁食不禁水8 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.7 mL/100 g)，麻醉后，取脾脏、胸腺称重，称重后的脾脏进行固定，将固定后的脾脏HE染色。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠扭体次数、耳肿胀重量差值比较

由表1可见，与空白组比较，蜂针蜇刺5 min、1 min、30 s、阳性对照药组都对小鼠的扭体次数有显著的抑制作用(P<0.01)。与空白组比较，蜂针蜇刺5 min、1 min、阳性对照药组都对小鼠耳肿胀重量差值有抑制作用(P<0.05)。

表1 小鼠扭体次数、耳肿胀重量差值的比较

2.2 各组大鼠的足肿胀体积、足厚度、足周长比较

由表2可见，与模型组比较，在造模前1天，各治疗组和空白组的都没有差异；与模型组比较，在治疗15 d后，蜂针蜇刺5 min、1 min足肿胀体积有减小(P<0.05)，阳性对照药组有显著减小(P<0.01)；与模型组比较，在治疗35 d后，蜂针蜇刺5 min、1 min、30 s、阳性对照药组都有显著减小(P<0.01)。

表2 各组大鼠的足体积比较

由表3可见，与模型组比较，在造模前一天，各治疗组和空白组的足厚度都没有差异；与模型组比较，在治疗15 d后，蜂针蜇刺5 min、1 min、30 s 、阳性对照药组的足厚度都有显著增高(P<0.01)；与模型组比较，在治疗35 d后，蜂针蜇刺5 min、1 min、30 s、阳性对照药组的足厚度都有显著增高(P<0.01)。

表3 各组大鼠的足厚度比较

由表4可见，与模型组比较，在造模前1天，各治疗组和空白组的足周长都没有差异；与模型组比较，在治疗15 d后，蜂针蜇刺5 min、1 min、30 s、阳性对照药组的足周长都有显著增加(P<0.01)；与模型组比较，在治疗35 d后，蜂针蜇刺5 min、1 min、30 s、阳性对照药组的足周长都有显著增加(P<0.01)。

表4 各组大鼠的足周长比较

2.3 各组大鼠的脾脏重量、胸腺重量比较

由表5可见，与模型组比较，蜂针蜇刺5 min、1 min脾脏重量有减小(P<0.05)，蜂针蜇刺30 s、阳性对照药组有显著减小(P<0.01)；与模型组比较，蜂针蜇刺5 min、1 min、30 s、阳性对照药组胸腺重量都有显著减小(P<0.01)。

表5 CIA模型脾脏、胸腺重量的比较

2.4 各组大鼠脾组织形态比较

由图1可见，脾组织形态比较可见，空白组淋巴小结结构清晰，胞核胞浆界限分明。模型组淋巴小结结构基本破坏，伴随着大量炎性细胞浸润，并出现大量的出血点，部分细胞核溶解或破碎，淋巴细胞轻度增生，体积变大，白髓和红髓界限不清晰。阳性对照药组淋巴小结结构正常，胞核大小均一，排列整齐。蜂针蜇刺5 min组出血点明显减少，淋巴小结结构基本恢复正常，红髓结构有所恢复。蜂针蜇刺1 min组淋巴小结结构有所恢复，但不够完整，局部区域出血点较多。蜂针蜇刺30 s组部分淋巴小结结构有所恢复，但部分淋巴细胞仍有增生现象。

3 讨论

本研究表明，蜂针治疗在镇痛和抗炎作用上有明显的意义，在类风湿模型大鼠上也有明显的改善肿胀关节的作用和调节免疫的作用，同时还可以影响病变的骨组织。

蜂疗主要是通过蜜蜂蜂针将蜜蜂体内的活性物质带入人体内，现在研究表明，蜜蜂毒囊中主要成分是蜂毒，蜂毒是存在于蜜蜂毒囊中由毒腺分泌的无色芳香液体，其化学成分复杂，主要包括活性酶类(透明质酸酶、磷酸酯酶A2)、多肽类(蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大细胞脱粒肽、镇静肽等)、糖类、脂类、氨基酸类和胺类物质等[6-7]。目前，蜂针蜂毒在临床中有着非常广泛的应用，涉及运动、呼吸、循环、神经、消化、内分泌、泌尿、生殖等各大系统，包括疼痛、炎症、肿瘤、自身免疫病等多种疾病[8-14]。现代研究发现，蜂毒肽是人类目前发现的最强的抗炎物质之一，其抗炎强度是氢化可的松的100倍，具有类激素样的作用，但却没有其副作用[7]。蜂毒肽可以刺激机体分泌皮质激素，阻止局部炎症的发生[1]。

类风湿性关节炎是一种以关节红肿热痛、晨僵、胃纳不佳的慢性系统性疾病。疾病晚期会出现关节畸形, 活动受限, 甚至导致肢体永久性残疾。其病因未明，考虑可能与遗传、感染、性激素等有关。其治疗目前主要分为西医和中医两方面, 西医通常是采用抗炎镇痛、免疫抑制等方法, 其优势是可以暂时控制住病情的发展, 但存在具有较大的毒副作用等缺点。而中医方面主要是中药内服、外敷、针灸、穴位注射等。随着中医治疗的发展，其治疗效果有很大的进步，同时可以有效地减少不良反应的发生。其中近期临床研究发现，蜂针蜇刺治疗在临床上有很大的应用空间，不但可以取得良好的治疗效果，也可以减少毒副作用带来的痛苦[9，15-18]。

图1 蜂针蜇刺对CIA大鼠脾脏组织的影像(HE，×100)

本研究的目的就是在实验层面上验证蜂针蜇刺的效果，通过实验发现，蜂针蜇刺治疗可以有明显的镇痛抗炎作用，同时对类风湿模型大鼠的足肿胀、足周长、足厚度、脾脏重量、胸腺重量、脾脏组织病理结构有明显改变，提示蜂针蜇刺治疗有可能在炎症抑制上有很好的作用效果，但仍需要更进一步的机制研究来进行验证。综上所述，蜂针蜇刺治疗可以有效改善类风湿模型大鼠的疾病情况，为以后在机制层面更好的进行研究提供基础依据。