夫西地酸联合抗生素抑制脓肿分枝杆菌的研究

何志群， 滕 飞， 高 超， 曾雪婷， 许馨月， 杜佳依， 李树华， 曾菊梅， 汪 川

(1. 四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院 中毒、检验与精准防治研究转化中心， 成都 610041; 2.四川大学生物治疗国家重点实验室， 成都 610041; 3.四川大学华西医院人类疾病与免疫治疗实验室， 成都 610041; 4.陆军军医大学陆军特色医学中心药剂科， 重庆 400042)

1 引 言

脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus,M.ab)是一种具有多重天然耐药性的快生型非结核分枝杆菌(Nontuberculous mycobacteria, NTM)，引起人体严重的呼吸道、皮肤和粘膜感染.感染主要通过伤口(导管或其他暴露的表面)与环境或受污染的设备(手术器械等)直接接触而发生[1-3].近年来，脓肿分枝杆菌在临床感染的患者人数迅速增加，而可供选择的治疗药物相对匮乏，已经成为了不可忽视的临床问题.

已经有证据表明，脓肿分枝杆菌感染可能通过气溶胶或接触污染物的方式在人与人之间传播[4-5].脓肿分枝杆菌因其固有的多重天然耐药性导致对大多数常规抗生素及抗结核化合物广泛耐药，治疗时药物选择比较局限.分离菌株的体外药敏结果以及患者用药史是选择联合用药方案的重要参考：克拉霉素、阿奇霉素、头孢西丁、阿米卡星、替加环素、亚胺培南/西司他丁等药物对脓肿分枝杆菌具有较好的体外抑菌活性，临床上选择上述药物联合使用治疗脓肿分枝杆菌感染.脓肿分枝杆菌药敏试验与临床疗效相关性不确定以及获得性耐药使得治疗效果更不理想，治愈率仅30%～50%.其中新型大环内酯类药物对大多数NTM治疗比较有效，但脓肿分枝杆菌因其单拷贝靶标基因突变容易产生克拉霉素(23S rRNA基因)和阿米卡星(16S rRNA基因)的获得性抗性突变，产生耐药，导致治疗失败.头孢西丁联合治疗快生分枝杆菌患者确实能够提高治愈率，但在临床菌株中检测到该药物敏感性下降[6-7].其他治疗脓肿分枝杆菌的药物在临床上也存在不同程度的获得性耐药现象发生，导致患者无法获得长期的痰培养转阴结果以及临床症状的改善[8].在目前的抗生素选择下，脓肿分枝杆菌感染对大多数患者来说是一种难以治愈的慢性感染.因此寻找新的抗菌药物策略包括老药新用以及联合用药对于选择抗脓肿分枝杆菌药物尤其重要.

夫西地酸(Fusidic acid，C31H48O6)对革兰氏阳性球菌尤其对葡萄球菌高度敏感，对某些革兰氏阴性菌有一定的抗菌作用，也可抗厌氧菌感染，与其它抗生素无交叉耐药性，常用于细菌性治疗.多项体内外研究[9-12]表明夫西地酸联用其他抗生素对葡萄球菌协同抗菌作用显著，能够明显缩窄金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的耐药突变选择窗，抑制耐药突变体的产生.另外夫西地酸联用氨曲南或粘菌素对耐药铜绿假单胞菌具有协同抗菌作用，夫西地酸联用策略能够一定程度逆转菌株对药物由耐药变为敏感状态[13-14].已经发现部分分枝杆菌对夫西地酸具有一定程度的敏感性，包括堪萨斯分枝杆菌，麻风分枝杆菌，以及结核分枝杆菌.计算机成功模拟预测分枝杆菌FtsZ (Filamentous temperature-sensitive mutant Z)是夫西地酸作用的有效靶点[15].

本研究首先开展了夫西地酸对脓肿分枝杆菌的抑菌活性研究，首次发现夫西地酸对脓肿分枝杆菌具有较好的体外抑菌活性；然后进一步开展了夫西地酸联合阿奇霉素等药物对脓肿分枝杆菌的抑菌活性研究，得到具有良好协同作用的两种药物组合，为临床开发新的治疗脓肿分枝杆菌感染药物方案提供参考.

2 材料和方法

2.1 材 料

2.1.1 实验菌株： 脓肿分枝杆菌标准菌株(ATCC 19977)；脓肿分枝杆菌临床分离株7株(MAB-S1、MAB-S2、 MAB-S3、 MAB-R1、 MAB-R2、 MAB-R3、 MAB-R4)由四川大学华西第四医院微生物室提供.

2.1.2 药物与培养基 夫西地酸由四川大学生物治疗国家重点实验室余洛汀教授课题组提供；阿奇霉素(Azithromycin, C38H72N2O12，批号：C11104216)和头孢曲松钠(Ceftriaxone sodium, C18H17N8NaO7S3，批号：C11330323)均购自上海麦克林生化科技有限公司；贝达喹啉(Bedaquiline, C32H31BrN2O2，批号：B349211337769)购自美国APExBIO公司；7H9肉汤/琼脂培养基(BD-Difco)均严格按照说明配制，4 ℃保存备用；Resazurin(麦克林生化科技)，二甲基亚砜DMSO (MP Biomedicals)，Tween 80 (Sigma-Aldrich).

2.2 实验方法

2.2.1 脓肿分枝杆菌的准备 接种环挑取复苏活化后的单个菌落在10 mL 7H9肉汤培养基中，37 ℃摇床恒温振摇至菌液生长到对数生长期：以7H9肉汤培养基作空白对照管，测得OD在600 nm波长下吸光度约为0.5时，取菌液与新鲜7H9肉汤培养基稀释制备菌悬液备用(约1×104CFU/mL).

2.2.2 药物准备 夫西地酸溶解于DMSO，头孢曲松钠溶解于无菌水，阿奇霉素溶解于无水乙醇，三种药物均配制为10 mg/mL的储存浓度；贝达喹啉溶解于无菌水，配制为5 mg/mL的储存浓度，经0.22 μm滤膜过滤除菌后-20 ℃冻存备用.

图1 药物结构示意图Fig.1 The structure of Chemicals

2.2.5 最小杀菌浓度(MBC)测定 96孔板微量稀释药敏试验培养后，分别取各药物单独作用和药物联用MIC90及MIC90以上三孔(无明显细菌生长孔)的孔中50 μL菌液(包括生长对照菌液)作10-1、10-2、10-3、10-4稀释后均匀涂布到无药物的7H9琼脂培养基上，一式三份，平板于5% CO2培养箱37℃倒置培养3 d，进行菌落计数.规定能够杀灭培养基内99.9%的细菌(与无药生长对照孔平板培养后菌落数比较)的最小药物浓度作为该药的最小杀菌浓度MBC.

2.2.6 脓肿分枝杆菌临床株验证药物协同作用 采用2.2.4中方法先在96孔微孔板中测定夫西地酸与阿奇霉素、头孢曲松钠、贝达喹啉4种药物单独作用临床脓肿分枝杆菌的体外抑菌作用，获得各药物针对临床株的单独MIC.结合各药物联用抑制标准株的结果，设置药物两两联用浓度梯度检测联用方案对临床株的体外抑菌活性，比较脓肿分枝杆菌标准株与临床株对联合用药方案的体外敏感情况.夫西地酸联用阿奇霉素的浓度为：200/50、 100/25、 50/12.5、 25/6.25、 12.5/3.13、 6.25/1.56、 3.13/0.78、 1.56/0.39、 0.78/0.20、 0.39/0.10 μg/mL；夫西地酸联用头孢曲松钠的浓度为：200/50、 100/25、 50/12.5、 25/6.25、 12.5/3.13、 6.25/1.56、 3.13/0.78、 1.56/0.39、 0.78/0.20、 0.39/0.10 μg/mL(个别不敏感菌株从200/400或400/200起始浓度向下2倍梯度稀释)；夫西地酸联用贝达喹啉的浓度为：200/3.13、 100/1.56、 50/0.78、 25/0.39、 12.5/0.20、 6.25/0.10、 3.13/0.05、 1.56/0.02、 0.78/0.01、 0.39/0.006 μg/mL；在96孔板上得到两种药物不同浓度的组合，按照上述操作测定各浓度组合下对脓肿分枝杆菌临床株的生长抑制率.根据药物单独作用和联用时MIC计算FICI值，评估分析不同药物组合联用对临床株的抑菌效果.

3.1 药物的最低抑菌浓度

微孔板二倍稀释法测定MIC实验结果表明，针对脓肿分枝杆菌的体外抑菌活性测定，单独使用夫西地酸、阿奇霉素、头孢曲松钠和贝达喹啉时MIC50分别为6.25、 1.56、 1.56和0.78 μg/mL，MIC90分别为50、 6.25、 3.13及3.13 μg/mL (结果见图2).

图2 MABA法测定药物单用对脓肿分枝杆菌的MIC结果

3.2 夫西地酸分别联用三种药物的协同效应

夫西地酸分别联用阿奇霉素、头孢曲松钠和贝达喹啉对标准脓肿分枝杆菌的抑菌作用，随着药物联用浓度不同而表现出不同的抑菌效果(结果见图3).夫西地酸与阿奇霉素联用表现出协同作用，当12.5 μg/mL夫西地酸联用0.39 μg/mL阿奇霉素(或3.13 μg/mL 夫西地酸联用1.56 μg/mL阿奇霉素)对脓肿分枝杆菌抑菌作用效果最佳，表现出协同的抗菌作用，夫西地酸联用剂量降低为单用的1/4，同时阿奇霉素联用剂量降低为单用的1/16.夫西地酸与头孢曲松钠联用同样表现出协同作用，当6.25 μg/mL夫西地酸联用0.39 μg/mL头孢曲松钠对脓肿分枝杆菌抑菌作用效果最佳，表现出协同的抗菌作用，夫西地酸联用剂量降低为单用的1/8，同时头孢曲松钠联用剂量降低为单用的1/8；夫西地酸与抗结核药物贝达喹啉联用表现出相加作用，即6.25 μg/mL夫西地酸联用 1.56 μg/mL贝达喹啉效果最佳，夫西地酸联用剂量降低为单用的1/8，贝达喹啉联用剂量降低为单用的1/2.

上述结果表明,夫西地酸与三种药物联用皆能够表现出良好的协同或相加作用；三种组合中，夫西地酸与大环内酯类抗生素阿奇霉素或与头孢菌素类药物头孢曲松钠联用协同抑菌效应良好，与二芳基喹啉类抗结核药物贝达喹啉仅表现出相加作用，无协同作用(结果见表1).

图3 棋盘格法测定夫西地酸联用药物对脓肿分枝杆菌的抑菌结果

3.3 药物的最小杀菌浓度

实验结果表明，夫西地酸与阿奇霉素、头孢曲松钠和贝达喹啉对标准脓肿分枝杆菌的MBC分别为50、12.5、3.13、6.25 μg/mL，四种药物的单用MBC与MIC比值范围在1.0～2.0，说明对标准脓肿分枝杆菌具有良好的杀菌活性.药物联用后MBC有所下降，夫西地酸联用阿奇霉素后，夫西地酸的MBC降低4倍，阿奇霉素的MBC降低16倍；夫西地酸联用头孢曲松钠后两者的MBC皆降低8倍.结果表明夫西地酸联用上述两种药物能够增强其对脓肿分枝杆菌的杀菌作用，降低药物的体外最小杀菌浓度，夫西地酸与阿奇霉素联用能显著降低阿奇霉素的最小杀菌浓度 (结果见表2).

表2 夫西地酸及三种药物作用于脓肿分枝杆菌的MBC结果

3.4 联合用药对脓肿分枝杆菌临床株的协同作用

夫西地酸与阿奇霉素、头孢曲松钠和贝达喹啉对脓肿分枝杆菌临床株的最小抑菌浓度与标准株有所不同(结果见图4).夫西地酸对S型临床株的MIC90为100 μg/mL，对R型临床株的MIC90为100～200 μg/mL，相较于标准株(50 μg/mL)有1～2倍升高；阿奇霉素对S型和R型的MIC90分别为3.13～50 μg/mL及1.56～6.25 μg/mL，表明阿奇霉素对R型菌落更加敏感；贝达喹啉对S型和R型的MIC90分别为0.20～0.78 μg/mL及0.10～0.20 μg/mL；当夫西地酸联用阿奇霉素作用于脓肿分枝杆菌临床株后，三个S型临床株的FICI值为0.09～0.28，皆小于0.5，表现出协同作用.其中MAB-S1株夫西地酸联用剂量降低为单用的1/32, 同时阿奇霉素联用剂量降低为单用的1/4.类似地，针对MAB-S2株夫西地酸联用剂量降低为单用的1/16, 阿奇霉素联用剂量降低为单用的1/16.而针对MAB-S3株夫西地酸联用剂量也降低为单用的1/16, 阿奇霉素联用剂量则降低为单用的1/32;另外四个R型临床株的FICI值为0.53～1.06，无协同作用.夫西地酸联用头孢曲松钠对于脓肿分枝杆菌临床株并未表现出针对标准株相似的协同作用，S型和R型的FICI指数均在0.5～1.5之间，表现出相加或无关作用.夫西地酸联用贝达喹啉对于临床株的FICI指数在1.12～1.5之间，仅表现出无关作用.

体外联合药敏结果表明夫西地酸与三种药物联用也能够在脓肿分枝杆菌临床株上一定程度表现出良好的协同或相加作用；其中尤其以夫西地酸与阿奇霉素联用针对S型临床株协同效应最好，极大地降低药物浓度(最高达32*16倍).与头孢曲松钠、贝达喹啉仅表现出相加或无关作用，无协同作用(结果见表3).

图4 脓肿分枝杆菌临床株验证夫西地酸联用阿奇霉素的协同作用

表3 夫西地酸联合三种药物作用于脓肿分枝杆菌临床株结果

4 讨 论

NTM普遍存在于自然界土壤和水等环境中，人和动物均能被感染.全球NTM感染的发病率和患病率整体呈现动态增长趋势，在部分国家和地区甚至超过结核发病率.我国鸟分枝杆菌复合群和脓肿分枝杆菌复合群是引起NTM肺病最常见的病原体[20-21].NTM肺病属于慢性病，临床症状与结核病相似，对抗结核药物天然耐药，容易被误诊误治.脓肿分枝杆菌的固有广泛耐药性源于细胞壁的低渗透性、缺乏药物活化系统、外排泵的诱导和广泛的药物修饰酶的产生[22-23].

夫西地酸是一种具有类甾体骨架的抗生素，从梭链孢酸脂球真菌中获得，通过干扰延长因子G阻止核糖体易位抑制细菌的蛋白质合成发挥抑菌或杀菌作用.夫西地酸自从1962年被提取出来后被多个国家批准于临床应用，不良反应轻，有组织穿透力强、药物浓度高以及更安全可靠等特点高效抗菌，因其独特的抑菌机制而不易与其它抗生素发生交叉耐药.本文探究夫西地酸对具有天然耐药性的脓肿分枝杆菌的抗菌活性，以及夫西地酸联合阿奇霉素等药物对脓肿分枝杆菌的协同抑菌作用.

阿奇霉素为十五元大环内酯类抗生素，和克拉霉素被认为是近20年来治疗NTM病的重要新药.其作用机制是通过阻碍细胞核蛋白 50S 亚基的联结来抑制蛋白质合成从而发挥抑菌作用，脓肿分枝杆菌对其相对不易产生耐药.本研究中夫西地酸单独作用于脓肿分枝杆菌的MIC值较高，4株S型菌株(包括标准株)与4株R型菌株的MIC90分别为50～100 μg/mL 与100～200 μg/mL.阿奇霉素单独作用于4株S型菌株与4株R型菌株的MIC90为3.13～50 μg/mL、1.56～6.25 μg/mL.S型菌株中两株为阿奇霉素耐药，4株R型菌株皆为阿奇霉素敏感或中度敏感.联合用药后标准株的夫西地酸与阿奇霉素MIC90降为1/4 (12.5 μg/mL)与1/16 (0.39 μg/mL)，临床株的夫西地酸与阿奇霉素MIC90降为1/32 (3.13 μg/mL)与1/32 (1.56 μg/mL)；夫西地酸联用阿奇霉素后可以极大地降低抗生素使用剂量，恢复阿奇霉素对耐药脓肿分枝杆菌(MAB-S2、 MAB-S3)的敏感性.夫西地酸联合阿奇霉素用药组合对肺炎支原体以及耐药肺炎支原体也表现出体外协同抑菌作用[24].脓肿分枝杆菌分为光滑型和粗糙型两种菌落形态，单用时R型菌落相比S型菌落对阿奇霉素更敏感，推测可能与粗糙型脓肿分枝杆菌的细胞壁上糖肽磷脂类物质含量比较低，阿奇霉素药物更容易进入胞内有关；其次夫西地酸联用阿奇霉素仅在S型菌落上展现出优异的协同作用，可能因为夫西地酸作为类固醇抗生素，具有强大的脂溶性，良好的渗透力有助于阿奇霉素进入细胞内部作用于核蛋白发挥抑制脓肿分枝杆菌生长和繁殖的作用.同时R型菌落更容易高度聚集，群体抵抗阿奇霉素的能力相比S型更强；已有文献[25]证明脓肿分枝杆菌R型菌落在人巨噬细胞中接受阿奇霉素处理后存活率较S型菌落显著更高，本次实验在临床株上也同这一现象一致.

头孢曲松钠是第三代头孢菌素类抗生素，属于β-内酰胺抗生素，通过结合细菌的青霉素结合蛋白而抑制胞壁的合成达到抗菌作用.同样的，头孢曲松钠单用MIC90为3.13 μg/mL，与夫西地酸联合用药后MIC90为0.39 μg/mL.头孢曲松钠与夫西地酸联用，推测可能是头孢菌素作用于脓肿分枝杆菌细胞壁造成胞壁破损，更利于夫西地酸进入胞内作用于核糖体发挥作用，但是这一协同现象并未在临床株中观察到.贝达喹啉是一种二芳基喹啉抗结核新药，用于耐多药结核病联合治疗，通过抑制分枝杆菌ATP合酶阻断能量供应发挥作用.在体外对脓肿分枝杆菌有很好的抑菌活性，但其杀菌活性较弱[26-27]，本研究发现贝达喹啉单独的MIC90为3.13 μg/mL，与夫西地酸联合用药后MIC90为1.56 μg/mL，该结果与文献中趋势一致，且与夫西地酸联用也仅表现出相加的抑菌活性，无杀菌活性方面的改变，在临床株中联合用药结果与标准株大致一致，仅观察到相加与无关作用.

本研究结果可提示临床疑似脓肿分枝杆菌除进行分子菌种鉴定以外，还需进行必要的分离培养以便菌落分型，单药药敏辅以联合药敏试验，能为更有效地诊断和治疗脓肿分枝杆菌感染提供重要参考.针对类似阿奇霉素等抗生素出现临床分离菌株单药耐药情况时，可尝试与夫西地酸等不同抗菌机制的抗生素联用，一定程度上能够恢复对该药的敏感性，增加可供选择的治疗药物，同时也降低各药物使用剂量，减少单药耐药的产生.联合用药能为患者治疗带来除协同增加抗菌效能外更多的获益：降低毒副反应以及减少单药耐药发生，避免无药可治.老药新用策略正在成为发现常见病和罕见病药物的一种独特方法[28].药物再利用的优势不仅是因为它们的细胞毒性、作用机制是已知的，而且这些化合物的大部分不良反应都已经得到充分的证明，同时还能极大地降低药物开发成本.

夫西地酸及阿奇霉素的联合用药组合在体外对脓肿分枝杆菌标准株及临床株均具有良好的协同抑菌活性，该抑菌效果仍需在大样本临床株中进行验证，建立动物模型研究体内药效、药代试验，以及开展完全随机对照的临床试验来进一步观察临床效果，并最终为临床治疗脓肿分枝杆菌感染联合用药做出指导.