外周血DNA检测技术在孕妇胎儿异常染色体中与羊水穿刺技术对比分析

文 /王鹏，张宝仁，金莲华

据统计显示，我国大概有90万例/年新生儿出现生理缺陷，其中比较常见的原因是异常DNA，发病率可达0.6%，其中又以21-三体综合征较为高发[1]。基因的载体是染色体，异常DNA表达代表身体异常，基因表达异常，目前临床对其发病机制还未完全明确，研究认为跟DNA多种因素共同作用下发生断裂与重新连接有关[2]，在临床检查中多以羊水染色体核型分析作为此病诊断金标准，但毕竟是有创伤检查，孕妇依从性不高，而且操作烦琐，出结果用时长，难以把它作为普遍筛查项目[3]。随着近年来无创产前基因检测技术的迅猛发展，其广泛检测应用于孕妇胎儿染色体异常。本文旨探讨无创DNA检测技术在孕妇不同年龄及申请理由检测胎儿染色体异常的临床应用。

1 资料和方法

1.1 一般资料

2017年5月至2019年5月在浦东新区妇幼保健院接受产前诊断中心无创产前筛查（NIPT-plus)的孕妇3123位，纳入指标:（1）全部研究对象病历,检验检查项目及B超数据完整;（2）全部孕妇都没有任何身体异常表现,没有临床异常数据，NITP检查全部自愿，并于知情同意书签字；（3）不纳入指标：双胞胎以及以上者孕妇,短期内接受过干细胞治疗，免疫治疗、及短期内手术或有输血史。本文在经过院伦理委员会批准后进行。

1.2 方法

（1）①收集标本：孕妇取坐姿休息5分钟后使用血常规抗凝管采取孕妇4-5ml静脉血，在离心机内以1500rmin的转率离心15分钟，移液器采集血浆，对分离血浆进行再次离心，去除残留血细胞；②收集游离DNA：使用磁珠分离从收集血浆样本中经裂解、分离、纯化并提取游离DNA，为确保能够进行下一步实验，且保证DNA片段多态性具有代表性。收集过程需要建立SOP文件,保证采集血液的合格性。③制作检测测序库：将制备好的DNA片段行尾端恢复、补全，同时进行测序断基因扩增，文库和分纯,必须按所有操作按SOP文件进行，扩增后DNA浓度要大于0.2ng/mg，且DNA片段在150-200bp之间[4]；④测序与分析：使用3500测序仪(ABI)对DNA片段的基因序列,行电泳,提纯分析数据。对DNA检测结果为高风险孕妇进行相关咨询征得孕妇同意后进行介入产前诊断。

（2）羊水染色体核型分析通过超声定位后穿刺抽取孕妇羊水25ml，离心后取0.5ml沉淀、培养，得到分裂中期细胞，然后经过低渗、固定、吉姆萨染色处理，最后进行染色体核型分析。

（3）跟踪访问经电话或者查询我院病历记录等方式跟踪外周血DNA检测阴性产妇后续情况（包括有无流产、小孩身体情况等）。

1.3 统计学处理

通过SPSS28.0统计学软件进行数据的统计学分析。计量资料用均数标准差表述;计数资料采用例或百分率表示，计算NITP检测数据的敏感度及差异。

2 结果

（1）孕期不同NIPT阳性分布孕早期检出异常比例1.10%(10913)，孕中期异常比例0.95%(151575),孕晚期异常比例0.94%(7635)。详见表1。

表1 不同孕期NIPT阳性分布

（2）申请理由不同者NIPT异常分布高年龄段检出异常1.2%(10831)，外周血DNA异常比例0.94%(9957)，B超指标异常占1.1.1%(7635)，其他自己申请NIPT检查异常占0.71%(5700)。详见表2。

表2 不同申请NIPT理由者NIPT阳性分布

3 讨论

新生儿出现生理缺陷主要是由胚胎发育异常导致。其表现多为智力缺陷或器官形体或功能异常，胚胎异常主要由遗传因子决定，给家庭和社会带来沉重负担。为了解决新生儿出现生理异常，产前检查显得尤为重要[5]。遗传物质的载体是染色体，异常染色体是最常见出生缺陷原因[6]。尽管NITP已被广泛应用于产前非整数倍体应用当中,且检查为无创的,但对于比较罕见的染色体异常的临床应用价值逐渐被学者们提出异议,有学者认为染色体疾病并非流行性疾病,流行率较低,缺乏充分证据证明染色体检查有必要作为产前筛查指标，但血清学产前筛查是三级防控中的二级防控中重要的环节，对于我国出生缺陷防控有着重要意义[7]。但现阶段血清学筛查阳性率有限，就算是四联血清学筛查检测，阳性检出率也只有80%左右，且假阳性率较高[8]。NIPT因其无创性广受孕妇接纳。对以往的大面积筛查实验当中表明，使用NITP产前筛查能大量地降低羊水穿刺作为产前诊断金标准带来的创伤性检查，也在一定程度上降低了医疗资源的过度浪费和无效使用.诊断的目的在于防止新生儿有严重的染色体疾病，现阶段各类实验证明外周血DNA检测能够准确地检测出一批染色体疾病的新生儿，然而因为费用等问题，深度测序的CNV在用于临床筛查显得不切实际，所以采用低深度的外周血DNA检测作为临床筛查更显得极为重要，在保证了准确性和无创性的同时又保持了成本的可控，同时还实现了NITP的高效性。随着我们对数据库的不断完善社会对外周血DNA检测会逐渐认可，逐渐发挥其无创和准确的优点，未来造福人类。总之外周血DNA检测具有良好的效能，灵敏度和特异性都能满足现有临床需求。当然临床上应该进一步研究更具优良的方法[9-12]。