铁心杉半同胞子代优株父本鉴定

杨晓伟，朱宁华，韩志强，刘天宇，李 恒，杨 捷，朱新传

（1.中南林业科技大学 林学院，湖南 长沙 410004；2.安福县陈山林场，江西 吉安 343214）

杉木Cunningham lanceolate具有生长速度快、适应性强、木材价值高等优良特性，是我国南方重要的商品用材林树种[1]。随着国内外市场用材需求从原先单纯数量型向数量与木材品质转变，现有杉木良种数量和质量难以满足未来生产需求。铁心杉作为杉木的重要变种，发掘于湖南省永顺县小溪国家自然保护区，其心材现油亮的黑褐色，且心材比率大，木材坚硬如铁，耐腐，材性优于速生杉、红心杉、普通杉，是杉木中最为理想的商品用材林种质资源[2]。

杉木育种工作始于20世纪50年代，陈岳武等[3]于60年代首次将配合力的概念引入到杉木育种并计划应用到杉木的多世代改良中。自此国内有许多杉木研究者开展了大量的杉木杂交设计实验，洪昌瑞等[4]以149 个杉木为材料进行杂交设计，发现不同杂交组合间主要性状差异显著或极显著。陈代喜[5]对不同杂交设计的6年生杉木子代进行研究，发现不同杂交组合间也存在显著遗传差异，多父本授粉可以极大提高得到优良组合的几率且一般配合力差异较大的两个亲本杂交产生较高的特殊配合力。另外陈代喜等[6]对28年生杉木全同胞子代测定林研究发现树高、胸径和立木采集杂交组合间均呈极显著差异。李力等[7]通过测定杉木多系杂交子代发现组合杉木群组亲本间变异很大。姜年春等[8]在杉木杂交组合容器育苗中表明不同杉木杂交组合间的苗高、分指数、基径存在显著差异。以上研究表明，通过选择优良性状的亲本杂交开展杉木育种不一定产生性状同样优良的子代且耗时耗力，因此，传统杂交亲本的选配有一定的局限性。而亲本鉴定是可以基于天然优良半同胞子代追溯亲本来源，进而开展杂交育种工作，减少了育种的工作量，节约了时间成本，提高了育种效率，目前无相关对铁心杉半同胞子代进行父本鉴定的研究。

亲本鉴定主要包括父本鉴定和母本鉴定，通常情况下主要有观察记录和遗传标记分析两种方法[9]。天然群体中，亲本分析主要判定子代亲本来源，通常母本信息是已知的，因此主要以父本鉴定为主。对于木本植物而言，通过对每个子代及其候选父本进行遗传标记分析，采用遗传排除法或最大似然值法，可鉴定出候选父本。前者是基于孟德尔遗传定律，在天然的群体中，子代的等位基因一定来自杂交亲本，根据多位点遗传数据直接排除与后代具有不同位点的亲本，从而逐渐在候选父本中鉴定得到遗传父本。而最大似然值法最早由Meaghher[10-11]提出，通过估计亲本的似然性模型来预测最可能亲本来源，当选取多个连锁不平衡位点同时用于父本分析时，将每一个位点的似然值相乘，并取得自然对数，最后得到联合似然值（LOD），这种分析方法已经被用于分析已知母本，或者亲本均不明确的子代对应的遗传亲本，是亲本鉴定中最常用的方法[12-13]。SSR分子标记是一种共显性的分子标记，符合孟德尔遗传定律，可以提供大量的遗传变异信息，且成本低，操作便捷，在遗传结构分析、品种鉴定、指纹图谱构建和亲本分析中应用广泛[14-18]。王建忠等[19]利用11 对SSR 标记对桉树20 个基因型半同胞子代进行了父本鉴定和杂交亲本重建；王毓求等[20]利用10 个EST-SSR 位点对3 个南方红豆杉进行遗传变异和父本分析，揭示3 个自然授粉群体的雄性繁殖贡献率分别为37.5%、84%、18.91%，有效花粉传播距离为10.00～25.00 m，且花粉传播无明显固定模式；韩志强[21]利用14对SSR 引物对77 个优良单株进行父本鉴定，鉴定出59 个优株的父本，构建了49 个潜在优势杂交组合；张曙光、刘振、雷雨等均采用SSR 标记对茶树新品种进行了鉴定[22-24]。因此，利用SSR 标记进行父本鉴定在林木育种中应用是切实可行的。

本研究在野外踏查铁心杉的基础上收集铁心杉优良雌株自由授粉种子进行播种育苗，从中选择表现突出的优良单株幼苗，利用SSR 标记技术对优良半同胞子代父本来源进行鉴定，探讨自由授粉状态下的优良杂交亲本组合和父本繁殖贡献率，建立高配合力的铁心杉杂交亲本，以期为铁心杉选择育种和杂交育种提供科学理论基础，从而促进铁心杉的开发利用和育种进程。

1 材料与方法

1.1 材料

团队于2017年10月中下旬至10月底在湖南省小溪国家自然保护区收集优良母树的球果，于中南林业科技大学自然风干，收集铁心杉种子。2018年5月份进行穴盘播种育苗，经播种育苗得到10 株优良母树半同胞子代3 576 个。2021年1月，在育苗温室中，统计10 个母树半同胞子代幼苗苗高、地径、叶长、叶宽和叶面积，对其性状进行综合评价并排名获得半同胞子代优株。将获得的半同胞幼苗优株新梢、母本及周围所有候选父本的嫩叶放入5 ml 冷冻管，液氮迅速冷冻后放入-80℃冰箱中保存备用，共计463 份铁心杉种质材料。

1.2 DNA 提取及引物合成

利用天根生化科技（北京）有限公司生产的新型植物基因组DNA 提取试剂盒（DP320）提取铁心杉叶片全基因组DNA，操作见说明书；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量和纯度，WF2800-D3B紫外分光光度计检测DNA 浓度，各样本DNA 统一稀释为20～50 ng/uL，-20℃保存用于后续实验。

从铁心杉样本中随机选取20 个DNA 样本对候选的199 对杉木引物进行筛选，共选出稳定、多态且特异的15 对引物用来铁心杉优良半同胞子代父本鉴定[25-27]，引物合成及检测均由上海生物工程有限公司完成。其中，15 对SSR 引物正向引物F 端分别作4 种荧光（FAM、HEX、TOX 和TAMRA）标记，筛选出的15 对SSR 引物基本信息见表1。

表1 15 对SSR 引物信息Table 1 Information of 15 pairs SSR primer

1.3 PCR 扩增及产物检测

403 个候选父本、10 个优株母本及筛选得到的优良半同胞子代均采用同一反应体系，共计20 ul。其中10 ul 2 ×Tap PCR Mix(Tiangen)DNA，6 ul ddH2O，4 ul DNA 模板，上、下游引物各1 ul。PCR 反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30 s，60℃退火90 s，72℃延伸30 s，共35 个循环；60℃延伸10 min，最后4℃保存，琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物质量。将PCR 产物送去上海生物工程有限公司在ABI3730XL 自动测序仪上进行基因分型（Liz 600 为内标），GeneMarker 2.20 软件统计基因分型结果。

1.4 数据处理

将获得的基因分型数据导入GeneMarker2.20软件[28]统计基因分型结果，从而建立母本、候选父本及子代的基因型数据库。利用GenALEx6.5 软件[29]计算各个位点的遗传多样性参数，包括等位基因数（NA）、期望杂合度（HE）、观测杂合度（HO）；软件PIC_CALC Version 0.6[30]计算多态信息含量（PIC）。利用CERVUS3.0.7[31-32]软件对10 个优良母树自由授粉的半同胞子代幼苗优株进行父本鉴定，首先计算等位基因频率，得到等位基因频率分析文件；运行程序Simulation 中的paternity 子程序，选择等位基因频率文件，模拟10 000 次亲子鉴定；运行Parentage Analysis 程序中的paternity 子程序，输入候选父本及半同胞子代基因型文件、等位基因频率分析，估算各候选父本基因型最大似然对数比（LOD）值，根据LOD 的值大小判断最似父本。其中，LOD 值表示与随机父本相比，疑似父本传递给子代基因的可能性大小，当LOD 值大于0 时，表明所鉴定出的亲本为遗传亲本的可能性大于假设亲本，并且LOD 值越大，结果越可靠。

2 结果与分析

2.1 铁心杉半同胞子代幼苗优株建立

对10个半同胞家系中的3 576个子代的苗高、地径、叶宽、叶长、叶面积生长性状进行测定统计，制作箱线（图1A）。从箱线图中可以看出，不同母树子代各个性状表现不一，无法从单一性状来选择幼苗优株。因此通过R 语言中corrplot 包[33]将5 个性状进行相关性分析（图1B），5 个生长性状之间相关性系数较高，其中苗高与其他4 个性状均呈极显著正相关关系，地径与叶长、叶宽、叶面积成显著正相关关系，叶长、叶宽和叶面积两两成极显著正相关关系。相关性分析表明，5 个指标存在着较为密切的相关性，因此需要将5 个因子通过主因子分析降维，使其转化为少数几个互相独立的新指标，从而对半同胞子代进行综合评价。

图1 铁心杉子代生长性状箱线图及性状相关性分析图Fig.1 Box plot of growth traits and correlation analysis of traits

铁心杉5 个性状相关性分析如表2所示，前3个主因子的累积方差贡献率可达97.93%，能够满足对各个半同胞子代性状的评定，因此，选用前3个主因子对铁心杉进行综合评价得分。将主因子的特征值作为各个指标的权重，与各个指标相乘，得到主因子综合评价得分计算公式：

表2 铁心杉半同胞子代主要生长性状主成分分析Table 2 The factor analysis of main traits of the blackheart wood Chinese fir offspring

式（1）～（3）中：X1～X5分别为苗高、地径、叶长、叶宽、叶面积。

前3 个主因子的方差贡献率不同，在进行生长性状综合评价时，需要协调各因子的侧重关系，以3 个因子的贡献率84.16%、10.67%、3.1%为权重，结合3 个公因子的贡献率与因子得分Fi，参考综合得分计算公式可建立铁心杉半同胞子代主要生长性状综合得分数学模型：

参考以上综合得分计算公式，在10 个半同胞家系3 576 株子代幼苗中共筛选出50 株得分较高的优良子代单株（表3），以此来作为铁心杉父本鉴定的材料。

表3 铁心杉半同胞家系中入选子代幼苗优株Table 3 Superior plants selected in the black-heart wood Chinese fir half-sib hybrid progeny

2.2 父本鉴定

2.2.1 遗传分析

铁心杉DNA 及PCR 产物琼脂糖凝胶电泳检测如图2A—2B所示，15 个SSR 引物在铁心杉子代、母本及候选父本的扩增图谱如图2C所示（部分示意），遗传表达参数见表4，其中等位基因数在3～19 之间，平均为9.867，位点SSR6 上含有的等位基因最多为19 个，位点SSR14 及SSR15含有的等位基因最少为3 个；观测杂合度（HO）及期望杂合度（HE）变异范围为0.296～0.680 和0.460～0.887，平均为0.475 和0.679；多态信息含量（PIC）在0.356～0.876 之间，平均为0.634，其中有12 个SSR 位点多态信息含量（PIC）＞0.5，为高度多态位点，位点SSR1、SSR14 和位点SSR15 为中度多态位点，PIC 值分别为0.456、0.356和0.387；15 个SSR 位点多态信息含量较高，能够满足铁心杉半同胞子代父本分析需求。

表4 15 个SSR 位点多态检测及非父本排除概率Table 4 Polymorphism detection of 15 SSR loci and exclusion probability of non-paternal parents

图2 铁心杉DNA、PCR 产物检测及引物在半同胞子代与母本及疑似父本中的扩增图谱（部分示意图）Fig.2 DNA detection and polymorphic finger prints detected by SSR primer of half-sib progenies,parents

续图2Continuation of Fig.2

2.2.2 SSR 位点的非父排除率

由表4可知，当双亲基因型未知时，单个SSR 位点的非父排除概率（NE-1P）平均为0.700，最高为SSR14，0.894，最低为SSR6，0.370；当一个亲本的基因型已知时，单个SSR 位点的非父排除概率（NE-2P）的变化范围在0.227～0.821之间，平均值为0.540；当双亲已知时，单个SSR 位点的非父排除概率（NE-PP）变化范围为0.079～0.728 之间，平均为0.365。NA为等位基因数，HO为观测杂合度，HE为期望杂合度；PIC为多态信息含量，NE-1P为在候选父本中随机取样，被排除为疑似父本的概率；NE-2P为当母本已知时，在候选父本群体中随机取样，被排除为疑似父本的概率；NE-PP 为当父本母本均已知的情况下，在候选父本群体中随机取样，被排除为疑似父本的概率。

2.2.3 半同胞子代幼苗优株父本鉴定

筛选到的15 个SSR 位点用于50 个铁心杉半同胞子代的父本鉴定，其结果见表5。10 个优良母本子代幼苗优株的基因型均未出现与对应母本SSR 位点上相异的等位基因且在95%的置信水平下LOD 值均为正值，说明50 个子代在候选父本中均找到最似父本。

表5 铁心杉50 个半同胞子代父本鉴定结果Table 5 Identification of male parents of 50 half-sib progenies of the black-heart wood Chinese fir

50 个半同胞子代幼苗优株在候选父本中共鉴定出42 个唯一父本，42 个父本在50 个半同胞优株中分布频率如图3所示，其中TXS-14 的繁殖贡献率最高为6%，TXS-20、TXS-201、TXS-204、TXS-399、TXS-5 的繁殖贡献率次之，为4%，其余均为2%（图3）。

图3 候选父本被鉴定为优株父本的概率分析Fig.3 The frequency of the male plant identified as male parent

3 讨 论

优良亲本不一定产生优良子代，通过优良亲本杂交进行林木育种费时费力，而父本鉴定可以通过优良子代追溯亲本，降低了杂交工作的局限性，从而缩短育种进程，优良子代的筛选则为父本鉴定奠定基础和提供材料[9]。本研究共获得10株不同优株铁心杉3 576 个半同胞子代，并对半同胞株高、地径、叶长、叶宽和叶面积进行测量，利用R 语言对3 576 个半同胞子代的性状进行主成分降维分析，选取前3 个主因子的方差累积贡献率可达97.93%，建立铁心杉综合性状得分数学模型，进行综合评价共筛选出50 株铁心杉幼苗优株。

本研究选用已发表的15 对SSR 引物对自然授粉的铁心杉半同胞子代进行父本鉴定。通常认为，SSR 位点的多态信息含量（PIC）小于0.25 时位点为低度多态位点，PIC 介于0.25～0.50 时为中度多态位点，PIC 大于或等于0.50 时为高度多态位点[33]。本研究所筛选出的15 对SSR 位点的PIC 值在0.356～0.876 之间，平均值为0.634，86.7%的位点为中高度多态位点，表明所筛选得到的SSR 位点能够对铁心杉半同胞子代进行父本鉴定。利用CERVUS3.0 软件计算已知母本情况下的LOD 值，50 株幼苗优株在父本鉴定中LOD 均大于0，均能确定出唯一父本。虽然铁心杉天然群体花粉传播受很多因素的影响，但因为本研究疑似父本信息较全因此共鉴定出42 个唯一父本，其中TXS-14 的繁殖贡献率最高为6%，TXS-20、TXS-201、TXS-204、TXS-399、TXS-5的繁殖贡献率次之，为4%，其余均为2%。实验为10月份在野生天然林中采集铁心杉种子，可以确定母本，但是却无法确定母本周围的候选父本是否具有产生花粉的能力，候选父本数量的增加，降低了父本鉴定率，因此本研究父本鉴定率（9.77%）远远低于武星彤在红豆杉和韩志强在杨树父本鉴定的研究[21,34]，但本研究在铁心杉天然群体中筛选出了配合力的母本10 株，父本42 株，共计50 个潜在高配合力杂交组合。

在自然授粉的情况下，杉木主要依靠风力进行传粉，父本花粉的竞争力、花期一致性、亲本在群体中的位置以及风力和风向等因素会影响基因交流及半同胞子代的产生[20,35-36]，因此所选优株可能不能代表优良杂交组合后代群体的全部表现。但是，通过选取已知优良母本的优良半同胞子代，从而鉴定父本来源，构建铁心杉优良杂交组合，为铁心杉亲本群体构建提供一种策略，进而为铁心杉种子园的营建、新品种的开发、利用和保护提供了理论依据，高配合力亲本的筛选有利于铁心杉的繁育。SNP[37-38]是第三代分子标记，与SSR标记相比，具有数量更多、分布更广泛、遗传稳定性更高、易于快速进行基因分型等优点，其在群体扩增、遗传图谱构建方面具有非常广阔的应用前景，另外一个R 包和生物信息管道已经成功开发并应用于基于SNP 的亲子关系分析[39]。因此，开发合适的SNP 位点可作为今后铁心杉分子标记研究的重点，另外铁心杉种资源配置和种子园营建时应该充分考虑开花时气候条件、花粉的有效传播距离、亲本植株间距离等因素，以期获得子代的最高增益，实现铁心杉异地保存。

本研究利用已发表的杉木EST-SSR 标记对铁心杉半同胞子代进行父本鉴定，由于标记数量不够多等原因，这在一定程度上会影响父本鉴定结果，其结果存在与现有亲缘关系不一致的问题[40-41]。因此，后续研究将专门利用铁心杉幼苗材料开发EST-SSR 标记。

4 结 论

本研究在统计铁心杉半同胞子代幼苗优株生长特性的基础上，通过主成分降维的方法和思想筛选得到10 株铁心杉母本50 个半同胞子代幼苗优株；利用已发表的15 对SSR 引物、453 个候选父母本对50 个优株进行父本鉴定，鉴定出42 个唯一父本，且最高父本繁殖贡献率为4%，其余均为2%，共计得到50 个优良杂交组合，完成了自然授粉状态下铁心杉半同胞子代优株父本鉴定。