LINC00598靶向调控miR-381-3p影响宫颈癌细胞生物学行为的机制研究

蔡 晶 巫梦雪 张 婷 王 琳

宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，其发生率及病死率较高，且发病年龄有年轻化趋势[1]。肿瘤细胞的生长和转移是宫颈癌患者死亡的主要原因[2]。目前，手术治疗、化疗、免疫治疗、放疗等是其主要治疗手段，然而部分患者的预后较差[3]。宫颈癌的发病机制并未完全阐明，探究宫颈癌进展的分子机制可能对其临床治疗具有重要意义。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度不少于200个核苷酸的内源性RNA分子，其在不同肿瘤中的表达趋势差异显著，lncRNA通过参与调节肿瘤细胞内的生物学过程，影响肿瘤的发生和进展[4, 5]。

LINC00598在乳腺癌、结直肠癌、肝癌等肿瘤细胞系中高表达，可促进肿瘤细胞的增殖[6]。LINC00598在宫颈癌发展和转移中的作用机制并不清楚。本研究通过DIANA数据库预测发现LINC00598与miR-381-3p存在靶向序列。Shang等[7]研究表明，miR-381-3p通过直接靶向成纤维细胞生长因子7(fibroblast growth factor 7，FGF7)抑制宫颈癌进展。本研究旨在检测LINC00598在宫颈癌细胞系中的表达，通过在宫颈癌细胞系中沉默LINC00598表达，验证LINC00598对miR-381-3p表达的调控作用及对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响。

材料与方法

1.细胞与试剂:宫颈癌细胞C33A、HeLa、SiHa、HCC94及人正常宫颈上皮细胞H8购自美国标准培养物保藏中心。双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega公司。胎牛血清、DMEM/F12培养基、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶购自美国Amresco公司。无意义阴性序列、LINC00598小分子干扰RNA(siRNA:GGAUGUCUACAUAGAUUUAGA)、荧光素酶报告载体(LINC00598野生型载体、LINC00598突变型载体)、miR-381-3p模拟物、miRNA阴性对照购自上海吉玛生物制药有限公司。qRT-PCR试剂盒、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。MTT试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。Matrigel基质胶、Transwell小室购自美国Corning公司。一抗FGF7、β-tubulin、RAS、p-ERK1、myc-1及山羊抗兔二抗均购自美国CST公司。

2.细胞转染及分组:HeLa、SiHa、HCC94细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，C33A、H8细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。收集对数生长期HeLa细胞接种于24孔板，HeLa细胞生长融合至40%时，随机分为对照组(转染无意义阴性序列)和siRNA组(转染LINC00598小分子干扰RNA)，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。48h后，收集对数生长期HeLa细胞进行功能实验。

3. qRT-PCR检测LINC00598、miR-381-3p和FGF7 mRNA相对表达:利用TRIzol法提取细胞总RNA，根据反转录试剂盒说明书合成为cDNA。配置qRT-PCR反应体系，LINC00598和FGF7 mRNA以GAPDH为内参，miR-381-3p以U6为内参。LINC00598上游引物为5′-GGGGGAAAACATGCA-GAAT-3′，下游引物为5′-TTCACACTCTGAG-AAGACAAGGAC-3′；U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTC-ACGAATTTGCGT-3′；miR-381-3p上游引物为5′-TACTTAAAGCGAGGTTGCCCTT-3′，下游引物为5′-GGCAAGCTCTCTGTGAGTA-3′；GAPDH上游引物为5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物为5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；FGF7上游引物为5′-GCAACTGAACTTACTACGAACT-3′，下游引物为5′-ATTGACCTCTTCCTATCTGTGA-3′。采用2-ΔΔCt法计算LINC00598、miR-381-3p和FGF7 mRNA相对表达。

4.双荧光素酶报告基因检测验证LINC00598的靶基因:运用DIANA数据库预测LINC00598的靶基因为miR-381-3p。将荧光素酶报告载体(LINC00598野生型载体、LINC00598突变型载体)分别与miR-381-3p、miRNA阴性对照共转染至宫颈癌HeLa细胞，转染48h后收集细胞，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测每组HeLa细胞的相对荧光素酶活性。

5.Western blot法检测FGF7蛋白和RAS/ERK信号通路蛋白蛋白表达:收集各组宫颈癌HeLa细胞，采用蛋白裂解液提取总蛋白，蛋白煮沸变性，每组取50μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离后的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜，在7%脱脂牛奶中封闭。稀释一抗FGF7(1∶2000稀释)、β-tubulin(1∶2000稀释)、RAS(1∶2000稀释)、p-ERK1(1∶2000)、myc-1(1∶2000)，4℃摇床孵育10h。稀释二抗(1∶5000稀释)，摇床孵育2h。配置电化学发光液，采用凝胶成像系统曝光和显影。

6.MTT法检测HeLa细胞增殖:收集各组宫颈癌HeLa细胞，消化为单细胞悬液，以200微升/孔细胞接种于96孔板。分别于第1、2、3、4、5天，向每孔加入5mg/ml的MTT试剂20μl。培养箱中孵育4h，吸去上清，加入140μl二甲基亚砜，震荡15min，用全自动酶标仪检测波长450nm处各孔的吸光度(A)值，绘制HeLa细胞生长曲线。

7.Transwell实验检测HeLa细胞侵袭:采用预冷的培养基按照8∶1的比例稀释Matrigel胶，在Transwell小室上室加入30μl稀释液，培养箱内孵育3h。收集各组宫颈癌HeLa细胞，用不含胎牛血清的培养基稀释成单细胞悬液，以200微升/孔加入Transwell小室上室，下室加入含胎牛血清的培养基600μl。培养箱内培养24h，采用多聚甲醛溶液固定40min，采用0.2%结晶紫溶液染色40min，棉签擦去未侵袭的HeLa细胞，在100倍倒置显微镜下计数侵袭细胞数。

结 果

1. LINC00598与宫颈癌患者总生存期的关系:GEPIA在线数据库显示(图1)，LINC00598低表达的宫颈癌患者总生存期明显长于LINC00598高表达的患者，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1 LINC00598与宫颈癌患者总生存期的关系

2.LINC00598在宫颈癌细胞系中低表达:qRT-PCR检测结果显示(图2)，LINC00598在宫颈癌细胞(C33A、HeLa、SiHa、HCC94)及正常宫颈上皮细胞H8的表达分别为4.96±0.28、7.36±0.46、2.41±0.51、4.30±0.50和1.05±0.10。与H8细胞比较，宫颈癌细胞系中LINC00598表达显著升高(P<0.05)，其中LINC00598表达最高的细胞系是HeLa(P<0.01)。

图2 LINC00598在宫颈癌细胞系和正常宫颈上皮细胞中的表达与H8细胞比较，*P<0.05，**P<0.01

3.转染LINC00598小分子干扰RNA抑制HeLa细胞中LINC00598表达:转染LINC00598小分子干扰RNA后，siRNA组和对照组HeLa细胞中LINC00598表达分别为0.27±0.04和1.05±0.19，提示转染成功(P<0.01)。

4.生物信息学软件预测LINC00598的靶基因:DIANA数据库预测显示(图3)，LINC00598与miR-381-3p存在靶向序列。

图3 DIANA数据库预测LINC00598的靶基因

5.双荧光素酶报告基因检测验证LINC00598对miR-381-3p的靶向作用:双荧光素酶报告基因检测结果显示(图4)，在转染LINC00598野生型载体实验中，miR-381-3p组相对荧光素酶活性显著低于miRNA阴性对照组(P<0.01)。

图4 双荧光素酶报告基因法验证LINC00598对miR-381-3p的靶向作用与miRNA阴性对照组比较，*P<0.01

6.沉默LINC00598对miR-381-3p和FGF7 mRNA表达的影响:qRT-PCR检测结果显示，siRNA组和对照组HeLa细胞中miR-381-3p表达分别为6.74±1.49和1.01±0.22，差异有统计学意义(P<0.01)。siRNA组和对照组HeLa细胞中FGF7 mRNA表达分别为0.28±0.07和0.98±0.09，差异有统计学意义(P<0.01)。

7.沉默LINC00598对FGF7蛋白和RAS/ERK信号通路蛋白表达的影响:Western blot法检测结果显示(图5)，沉默LINC00598表达后，FGF7蛋白表达降低，RAS/ERK信号通路蛋白RAS、p-ERK1、myc-1表达增加，间质细胞表型蛋白Twist表达降低。

图5 沉默LINC00598对HeLa细胞FGF7蛋白和RAS/ERK信号通路蛋白表达的影响

8.沉默LINC00598对HeLa细胞增殖活力的影响:MTT法结果显示(图6)，在第2、3、4、5天，siRNA组HeLa细胞A值明显低于对照组(P<0.05)。

图6 沉默LINC00598对HeLa细胞增殖活力的影响与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

9.沉默LINC00598对HeLa细胞侵袭能力的影响:Transwell实验结果显示，siRNA组和对照组HeLa细胞的穿胶细胞数分别为95.47±13.18个和192.14±18.72个，差异有统计学意义(P<0.01，图7)。

图7 沉默LINC00598对HeLa细胞侵袭能力的影响A.Transwell实验穿胶细胞(结晶紫染色，×100)；B.Transwell实验定量结果

讨 论

既往研究表明，部分lncRNA如LINC00116、MIAT、FTH1P3、PVT1在宫颈癌组织中异常高表达，通过调控抑癌基因的失活，增强宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力，促进宫颈癌的恶性进展[8～11]。部分lnRNA如PTENP1、HAND2-AS1、UBE2R2-AS1、PTCSC3在宫颈癌组织中异常低表达，通过抑制癌基因的激活，降低细胞增殖活性，促进宫颈癌细胞凋亡[12～15]。因而，积极研究lncRNA在宫颈癌发生和发展过程中的作用机制，对改善宫颈癌临床治疗效果具有重要意义。Ghatnatti等[16]研究表明，LINC00598在垂体泌乳素瘤中高表达，其可能成为垂体泌乳素瘤发病机制的新型生物学标志物。Jeong等[6]研究表明，LINC00598在多种肿瘤细胞系中高表达，其可通过促进细胞周期蛋白2转录的稳定性，促进肿瘤细胞的增殖。本研究通过GEPIA在线数据库分析显示，LINC00598低表达的宫颈癌患者总生存期明显长于LINC00598高表达的患者，LINC00598低表达与患者生存期存在相关性。同时，本研究结果显示不同宫颈癌细胞系中LINC00598表达均明显增加，提示LINC00598在宫颈癌发生过程可能起到关键作用。细胞实验结果进一步显示，沉默LINC00598表达可抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖和侵袭能力，提示LINC00598能够抑制宫颈癌进展。

lnRNA主要通过与miRNA的相互作用，抑制miRNA对下游靶基因表达的干扰，参与宫颈癌的进程[17]。本研究通过DIANA数据库预测显示，LINC00598与miR-381-3p存在结合位点。同时，双荧光素酶报告基因实验证实LINC00598可靶向调控miR-381-3p表达。miR-381-3p在头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤等肿瘤中低表达，发挥抑癌作用[18,19]。miR-381-3p在宫颈癌组织和细胞系中呈低表达，miR-381-3p通过抑制靶基因FGF7表达，抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭，促进宫颈癌细胞的凋亡[7]。本研究结果显示，沉默LINC00598表达后，宫颈癌HeLa细胞中miR-381-3p表达显著增加，说明沉默LINC00598通过上调miR-381-3p表达改善宫颈癌细胞的恶性生物学行为。本研究结果显示，沉默LINC00598表达可显著促进宫颈癌HeLa细胞中FGF7基因的表达，进一步证明LINC00598通过调节miR-381-3p表达发挥作用。RAS/ERK信号通路在宫颈癌细胞中激活，促进宫颈癌的发生和发展[20]。FGF7基因表达降低后，RAS/ERK信号通路激活受到抑制。

综上所述，LINC00598在宫颈癌细胞系中高表达，沉默LINC00598表达可靶向上调miR-381-3p表达并且下调FGF7基因表达，抑制RAS/ERK信号通路激活，进而影响宫颈癌HeLa细胞的增殖及侵袭过程。LINC00598有望成为宫颈癌诊断和治疗的分子靶点。