心室减负荷对缺血性心力衰竭MMPs/TIMPs的影响

刘永辉 孟嘉天 孟自力 李 强 郑 浩 王浩东 邸红芹

心脏辅助装置特别是左心辅助装置(LVAD)除了作为心脏移植的“桥梁”外，还可作为治疗终未期心脏病的最终手段，但是其机制还没有完全清楚，而且，LVAD 对缺血性心肌病来说，远较其他病因的心脏病的疗效差[1,2]。

心室重塑被认为是各种病因导致晚期心脏功能衰竭共同的发病机制， 而与心室重塑的调控最为密切是基质金属蛋白酶(matrix metallopmteinases，MMPs)及其抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)，两者均是调控细胞外基质代谢的重要酶类，它们之间的协调平衡在心肌塑形、血管塑形、血管形成等方面起着重要作用，与心力衰竭心脏的疾病发展过程密切相关[3,4]。本研究选用缺血性心肌病模型来进行减负荷，以探讨减负荷对心室重塑中MMPs-TIMPs 轴的影响。

材料与方法

1.实验动物：本实验所使用的动物均为成年雄性同系lewis大鼠，首次手术前体质量180g～220g，由北京市维通利华实验动物技术有限公司提供。所有术前、术后实验动物均在笔者医院实验动物中心饲养。所有与实验动物相关的处理均符合《北京市实验动物管理条例》(1996年10月)。所有的动物实验均得到动物委员会的批准。

2.实验试剂及配方：异氟醚吸入麻醉剂购自美国百特(Baxter)公司，溴化乙锭(EB)购自美国Sigma公司，利多卡因(100毫克/支)国产，吗啡注射液，国产，10mg/1ml，溶于10ml 0.9%NaCl注射液备用。注射用长效青霉素(120万单位/支)购自墨西哥Lakinter公司。4%多聚甲醛：A液(8%多聚甲醛)以多聚甲醛干粉加蒸馏水配制，56℃水浴加温同时加入适量1mol/L的NaOH促进多聚甲醛溶解；B液(0.2mol/L PBS)每1000ml中溶解有NaH2PO45.928g，Na2HPO457.996g及NaCl 2g。A液和B液等比例混合即可，保存于4℃冰箱备用。

3.大鼠心肌梗死模型的制备：使用50ml针筒作为呼吸面罩连接683型小动物呼吸机，以氧气和异氟醚的混合气体3L/min进行维持吸入麻醉[5,6]。麻醉成功后大鼠右侧卧位，连接心电监测，消毒铺巾。经第5肋骨间逐层入胸。以左心耳下缘平齐位置为定位标记，用7-0滑线试结扎前降支，以心脏前壁局部颜色转为苍白为标准。结扎后可见心电示波有心肌梗死表现，大部分情况下出现室性心律失常。当左心室前壁部分颜色转为苍白且出现心电示波为心肌梗死时才能确认本模型制作成功。7×17丝线逐层关胸。

4.心力衰竭模型的制备及实验分组[5,6]：将形成24 只缺血性心肌病心力衰竭模型动物，随机分为两组，即减负荷组(n=14)与心力衰竭组 (n=10)，前者通过异位心脏移植的方法，形成左心室减负荷模型；后者不进行心脏移植。空白对照组(n=8)，大鼠接受开胸手术，但是不结扎冠状动脉。2周后，移植后的心力衰竭心脏、未移植的心力衰竭心脏、及正常心脏分别进行取材进行分析。

5.心功能的检测[7]：用心脏超声检测心力衰竭模型的心脏功能，用Langendoff模型测定心脏减负荷后的心脏功能，使用Powerlab配套软件(chart 4.0 for windows)计算每个测定点收缩末压力、舒张末压力、收缩末dp/dt、舒张末dp/dt以及发展压[7]。

6.TMPs 及TIMPs 的基因表达：从心脏组织提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，将mRNA反转录形成cDNA,即取2μg总RNA 在MMLV反转录酶(Promega)、Oligo(dT)15 37℃下孵育 1h，形成cDNA[3,8]。用5μl cDNA 在Tag DNA多聚酶下行PCR。GAPDH作内对照，检测MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9以及TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3。每个PCR产物用10μl进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外透照灯进行相应的分析[9,10]。

7.Western blot 法检测分析：取适量冰冻样品，置入细胞裂解液、匀浆、离心后，取上清液行浓度测定[8,11]。用抗 TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-9 的抗体，作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的相应抗体作为二抗，EB染色，拍照，密度扫描。计算出待测基因表达量与相应GADPH表达量的比值。

结 果

1.3组大鼠心脏功能变化：从心脏超声结果(图1A)可见， 与对照组比较，移植前心力衰竭组与减负荷组的FS及EF有明显下降，差异有统计学意义(P=0.000)，但是，心力衰竭组与减负荷组FS及EF比较，差异无统计学意义。Langendorff模型心功能评价(图1C)显示，减负荷2周后可以改善心脏功能。与心力衰竭组比较，减负荷组的左心室发展压有明显的升高，左心室发展压在左心室球囊容积为0.04ml时,差异有统计学意义(P=0.007)。

图1 3 组大鼠减负荷前后心功能的改变A.3组大鼠减负荷前射血分数的变化；B.3组大鼠减负荷前短轴缩短率的变化；C.3组大鼠Langendorff 检测的变化。与对照组比较，*P<0.01;Δ1mmHg=0.133kPa

2.3组大鼠MMPs 的表达：与对照组比较，心力衰竭组中的MMP-1、MMP-2和MMP-9 基因表达明显增加，差异有统计学意义，其中以 MMP-2 的上升更为明显。与心力衰竭组比较，在减负荷后，减负荷组的 MMP-2和MMP-9基因表达水平下降明显，差异有统计学意义。心力衰竭组与减负荷组MMP-7的基因表达水平比较，差异无统计学意义，详见图2。

图2 3组大鼠MMPs 的不同基因表达水平A.3组大鼠MMPs 的数据表达；B.3组大鼠MMPs 的基因变化。与心力衰竭组比较， *P<0.05,**P<0.01；与对照组比较，#P<0.05, ##P<0.01

3.3组大鼠TIMPs的表达：左心室减负荷改变了心力衰竭心脏的TIMP基因的表达 (图3)。与心力衰竭组比较，减负荷后的TIMP-2 和 TIMP-3 的基因表达明显升高,差异有统计学意义，其中TIMP-3升高更为明显，几乎达到正常水平。TIMP-1的升高虽然没有达到统计学意义，但也有所升高。

图3 3组大鼠TIMPs不同基因在减负荷2周后的表达水平A.3组大鼠TIMPs 的数据表达；B.3组大鼠TIMPs 的基因变化。与心力衰竭组比较，*P<0.05, **P<0.01

4.3组大鼠TIMPs/MMPs的比值：减负荷后 TIMPs/MMPs的比值也有所升高 (图4)。与心力衰竭组比较，TIMP-1/MMP-1的比值和 TIMP-3/MMP-9 均有明显升高 (P<0.05)； TIMP-2/MMP-2的比值升高更为明显 (P<0.01)。

图4 3组大鼠TIMPs/MMPs 基因表达的比值在减负荷2周后的表达水平A.3组大鼠TIMP1/MMP1的变化；B.3组大鼠TIMP2/MMP2的变化；C.3组大鼠TIMP3/MMP9的变化。与心力衰竭组比较，TIMP-1/MMP-1的比值和 TIMP-3/MMP-9 均有明显升高 (P<0.05)；TIMP-2/MMP-2 的比值升高更为明显(P<0.01);与心力衰竭组比较，*P<0.05, **P<0.01

讨 论

MMPs及TIMPs出现在心脏、血管等组织中，MMPs及TIMPs之间比例失衡导致正常纤维胶原降解增加及进行性心室扩张，从而影响细胞外基质的塑形，在心力衰竭的心室重构中发挥重要作用，因此，调节MMPs、TIMPs的活性及比例为限制心室重构和预防心力衰竭提供了一个重要的治疗手段[8,12,13]。

本研究通过对大鼠缺血性心力衰竭心脏进行移植构建减负荷模型，利用该模型来进行MMPs-TIMPs 轴的分析。在减负荷2周后，心力衰竭心脏MMP-1、 MMP-2和MMP-9的表达下降，TIMP-2和TIMP-3上升， TIMP-3/MMP-9、TIMP-1/MMP-1和TIMP-2/MMP-2三者之比均显著增高(尤其TIMP-2/MMP-2之比增高更为明显)，而 TIMP-1和MMP-7 的增高不明显。因此， 在判断心肌基质稳态方面，TIMPs与 MMPs之比值较单个MMPs或TIMPs 更敏感， TIMPs与 MMPs之比值更能反映基质的降解与修复的稳态，这一点与临床中患者的心力衰竭心脏的表达水平相似[14]。由于左心辅助的减负荷作用，使心力衰竭的心脏的TIMP-3与 MMP-9 之间不平衡得到恢复，从而产生了逆向重塑，使心脏功能得到恢复[1,13,15,16]。Kasten等[17]在扩张型心肌病心力衰竭的研究中发现，心脏减负荷后可以使心力衰竭后上升的MMP-1、MMP-9下降，TIMP-1 上升，从而维持 MMP-1/TIMP-1 比值的稳定。Klotz等[18]在另一扩张型心肌病的实验中发现，由于TIMP-3与 MMP-9 之间的不平衡，直接导致了细胞间质的降解加重，从而引起了扩张型心肌病。

在某些心肌病的实验显示，MMPs的抑制剂可抑制心室塑型、改善心脏功能，这提示降低MMP的活性，其利大于弊[12,13,19]。TIMP-3与MMP-9的比例不协调通过加速基质的降解而引起扩张型心肌病，反之，在临床上，由于机械减负荷，使TIMP-3与MMP-9的比例协调，调节了细胞外基质稳态及组织塑型，从而减轻心室重构[10,12,20]。本研究中减负荷2周后，VAD支持后心脏的MMPs和TIMPs保持较好的稳态，其可能机制是减轻了心脏组织的张力，减少了细胞渗出，减轻了炎性因子的剌激反应，缺血剌激了MMPs的产生，抑制了TIMP-1， MMPs 的降低及TIMPs的升高，可使正常心脏组织的破坏减轻。因此，VAD支持后心脏可以逆转MMPs和TIMPs 的比例，并增加心脏冠注。因此，笔者认为，减负荷改善心室重构的机制在于，其可能通过调节TIMP-MMPs之间旁分泌的机制，促进基质重构。

综上所述，本实验的心力衰竭后减负荷模型可以模拟临床上心力衰竭患者进行VAD情况。通过研究证实，MMPs-TIMPs轴在心力衰竭后减负荷中有一定的作用，减负荷可以显著降低心脏的MMP-1、MMP-2和MMP-9水平，升高TIMP-1和TIMP-3水平，从而使TIMPs-MMPs之比增高，其中，与单一的MMPs 或 TIMPs水平比较，TIMPs-MMPs对评估心肌的基质稳态更加敏感。