血清趋化素Chemerin及相关炎性细胞因子在非酒精性脂肪性肝病中的作用

吴明奇 杨晴柔 徐素美 陈芝芸

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与肥胖及胰岛素抵抗相关的代谢性慢性肝脏损伤疾病。目前，NAFLD在全球各地的平均发生率约为24%[1]。其中，20%～30% NAFLD患者会进展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，严重者可导致进行性肝纤维化和肝硬化甚至肝细胞癌[2]。趋化素Chemerin是新发现的一个脂肪细胞因子，有调节脂质代谢功能，并可通过刺激巨噬细胞上调CCL2、TNF-α等炎性介质的表达，诱发或加剧肝内的炎性反应[3,4]。本研究观察NAFLD患者血清趋化素Chemerin、CCL2、TNF-α水平变化，并分析其与肝细胞损伤、糖脂代谢等的关系，探讨血清趋化素Chemerin及其相关炎性细胞因子在NAFLD发生、发展中的作用和意义。

对象与方法

1.研究对象：收集2018年4～6月浙江中医药大学附属第一医院下沙院区体检中心受检并诊断为脂肪肝，且符合诊断标准、纳入标准及排除标准的患者110例，患者平均年龄为42.8±9.0岁，对入选患者进行流行病学问卷调查。同期纳入50例体检指标无异常，且除外相关肝病、可导致脂肪肝的相关疾病，以及各种严重慢性疾病的体检人群作为对照组，平均年龄为42.4±9.1岁。NAFLD组纳入标准：①年龄：18～65周岁；②符合NAFLD诊断标准，即参考中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组编写的《中国非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)》[5]。对照组纳入标准：①年龄：18～65周岁；②同一批体检人群中，明确排除NAFLD的健康体检者，且不饮酒者(无饮酒史或饮酒折合乙醇量男性<140克/周，女性<70克/周)。排除标准：①无病毒性肝炎、药物性肝炎等肝病；②自身免疫性疾病、胃肠外营养疾病、甲状腺功能减退等可导致脂肪肝的疾病；③心功能不全、肾功能不全、免疫缺陷性等各种严重慢性疾病；④不配合调查或资料不全者。研究方案经浙江中医药大学附属第一医院医学伦理学委员会审批并备案。

2.主要试剂：Human Premixed Multi-Analyte(Chemerin、CCL2、TNF-α)Kit，购自美国Bio-Techne公司(目录号LXSAHM-07)；葡萄糖检测试剂盒(产品号05168791190)、天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒(ALT)(产品号05850819190)、丙氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒(产品号05850797190)、谷氨酰转肽酶(GGT)检测试剂盒(产品号37435801)、甘油三酯(TG)检测试剂盒(产品号35652201)、总胆固醇(TC)检测试剂盒(产品号37225401)购自罗氏诊断产品有限公司；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒(产品号92649105)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测试剂盒(产品号92650120)购自中生北控生物有限公司。

3.主要仪器：Bio-Plex 200液相悬浮芯片系统为美国Bio-Rad公司产品；DX800型全自动血细胞分析仪型号为美国贝克曼公司产品；罗氏cobas8000全自动生化仪为瑞士罗氏诊断公司产品；LOGIG 500型超声诊断仪为美国GE公司产品。

4.研究方法：形体学参数检测：受检者脱鞋帽、穿单衣，由专人使用同一工具采用标准方法测量其体重、身高，分别精确到0.1kg和0.1cm，并计算体重指数(BMI)=体重(kg)/身高2(m2)。血压测定：使用启达QD-YTJ-A血压监测工作站测定血压，以坐立位休息5min以上，测定收缩压(systolic blood pressure，SBP)和舒张压(diastolic blood pressure，DBP)。肝脏B超检测：采用LOGIG 500型超声诊断仪[探头频率(3.5～5.0)MHz]行肝脏 B 超检查。生化指标检测：受检者在禁食8～12h后，次日晨采集空腹静脉血，采用全自动生化仪检测血糖、血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)和肝功能(ALT、AST、GGT)。采用 Luminex液相芯片法Bio-Plex 200 system高通量分析平台(Bio-Rad公司)检测血清中Chemerin、CCL2、TNF-α水平，操作步骤严格按照试剂盒提供的说明书进行规范化、标准化操作，通过配套的Bio-Plex Manager 软件包进行数据测定及分析，根据试剂盒提供的标准品做标准曲线(图1～图3)，根据标准曲线得出最终数值，保证结果的可靠性、准确性。

图1 Chemerin标准曲线

图2 CCL2标准曲线

图3 TNF-α标准曲线

结 果

1.NAFLD患者性别、BMI、血压、血糖、血脂、肝功能变化的变化：NAFLD组男性患者占较高比例，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；NAFLD组BMI、血糖、血压(收缩压及舒张压)、TG、TC、LDL-C、ALT、AST、GGT、水平显著高于对照组(P<0.01)，HDL-C水平则显著低于对照组(P<0.01)，详见表1。

表1 NAFLD患者性别、BMI、血压、血糖、血脂、肝功能变化

2.NAFLD患者血清趋化素Chemerin、CCL2、TNF-α水平的变化：NAFLD组血清趋化素Chemerin、CCL2、TNF-α水平均显著高于对照组(P<0.01)，详见表2。

表2 NAFLD患者Chemerin、CCL2、TNF-α的变化

讨 论

液相芯片是一种非常灵活的多功能技术平台，可进行蛋白、核酸等生物大分子检测及酶学分析、受体和配体识别分析等研究，被喻为后基因组时代的芯片技 术。与传统的ELISA法比较，具有快速、经济、高效的特点，对于以人群为目标临床大样本取样的研究，更是具有节省样体量的优势。本研究所使用的Bio-Plex Pro 200系统整合了双激光、激流系统和实时数据处理系统，特有的系统校正和校验工具，以进行内部质控，确保实验数据的精确性。

本组研究对象为浙江中医药大学附属第一医院体检人群，职业以公务员、企事业单位人员为主，研究结果提示，NAFLD组男女性别之比为97∶13，男性占比88.2%，明显高于女性，性别之间发生率的差异可能与男性、女性之间体内不同的激素调控相关[6]。

根据世界卫生组织全球卫生观察站2014年的数据表明，NAFLD发生率与肥胖指数密切相关[7]。本组资料也发现，NAFLD组较对照人群有更高的BMI指数。本研究NAFLD组较对照人群有更高的空腹血糖、TG、TC及LDL-C水平，而HDL-C较对照人群明显下降，提示NAFLD患者存在机体糖、脂代谢功能异常；同时，NAFLD组较对照组有更高的血压水平；这些结果也进一步表明NAFLD与代谢综合征关系密切，是代谢综合征在肝脏的表现[8]。

Chemerin主要由白色脂肪组织释放，在肝脏和肺中高度表达；通过刺激、诱导脂肪细胞和血管内皮细胞的增值、分化，以影响体内脂肪组织代谢平衡[9]。本研究发现NAFLD组较对照组血清趋化素Chemerin水平明显增高。Kajor等[10]研究发现，与体重指数≤40kg/m2的患者比较，体重指数>40kg/m2的患者血清趋化素Chemerin水平明显升高，说明血清趋化素Chemerin与肥胖关系密切。由于本组NAFLD患者中，BMI均≤40kg/m2(最高为35.22kg/m2)，为了评估BMI与血清趋化素Chemerin相关性，本研究根据中国肥胖问题工作组建议，将BMI值分为3组，即18.5～23.9kg/m2为正常组，24～27.9kg/m2为超重组，≥28kg/m2为肥胖组，结果提示血清趋化素Chemerin水平随BMI值的增高而增高(正常组为615.3±420.6pg/ml；超重组为1014.6±825.9pg/ml；肥胖组为1284.9±838.3pg/ml)，且正常组明显低于超重组和肥胖组，差异有统计学意义(P<0.01)，但超重组(n=65)与肥胖组(n=42)之间比较，差异无统计学意义[11]。本研究发现，MS相关标志物BMI(R=0.269，P<0.01)、TG(R=0.318，P<0.01)、SBP(R=0.310，P<0.01)、DBP(R=0.282，P<0.01)、血糖(R=0.242，P<0.05)与血清趋化素Chemerin呈正相关，HDL-C(R=-0.335，P<0.01)与血清趋化素Chemerin呈负相关，说明MS与血清趋化素Chemerin可能存在相关性。Kim等[12]研究发现通过改变饮食或加强锻炼可降低体重超重者、肥胖2型糖尿病患者血清趋化素Chemerin水平，也支持MS与血清趋化素Chemerin可能存在相关性这一观点。

CC趋化因子2(C-C motif chemokineligand 2，CCL2)又称单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是与CC趋化因子2受体 (C-C motif chemokineligand receptor2，CCR2)的主要配体，两者高亲和力的结合、活化后，能诱导肝内发生免疫和炎性反应[13]。动物实验证明，肠源性脂多糖和游离脂肪酸通过激活巨噬细胞表面的TLR-4，激活巨噬细胞的促炎程序，诱导巨噬细胞分泌CCL2、TNF-α等细胞因子[14]。趋化素Chemerin与其趋化因子样受体1(CMLKR-1)的结合促进巨噬细胞和自然杀伤细胞向组织损伤部位的活化，参与炎性反应[15]。本实验发现，NAFLD组较对照组有更高的CCL2、TNF-α水平，同时发现血清趋化素Chemerin与CCL2(R=0.490，P<0.01)、TNF-α(R=0.308，P<0.01)均呈正相关。由此，进一步分析了血清趋化素Chemerin与肝细胞损伤的相关指标的关系，结果发现，血清趋化素Chemerin与ALT(R=0.275，P<0.01)、AST(R=0.233，P<0.01)、GGT(R=0.359，P<0.01)均呈正相关，表明血清趋化素Chemerin可能参与了NAFLD的炎性反应。

笔者观察到，血清趋化素Chemerin、CCL2、TNF-α等炎性细胞因子水平在不同的NAFLD患者中个体差异比较大，分析原因可能与本组资料均为体检患者，未进行单纯性脂肪肝、NASH的分组分析有关。若需进一步的研究，需要扩大样本量，同时有必要通过超声、磁共振弹性成像等技术进行NAFLD严重程度分级，这样可望得出更能反映NAFLD炎性细胞因子与肝脏不同程度脂肪变相对比的结果。迄今为止的大多数研究表明，血清趋化素Chemerin与NAFLD有关联，但血清趋化素Chemerin和肝趋化素Chemerin mRNA之间尚未发现可靠的相关性，需要在未来的研究中加以关联和扩展。