响应面法优化长泰砂仁总黄酮提取工艺研究

★ 李秋玲 谢伟容 关梦瑶 郑瑞燕 曾立钦 张清懿（.漳州卫生职业学院药学系 福建 漳州 363000；.福建中医药大学 福州 350）

长泰砂仁是闽南民间颇具地方特色的一味草药，常以传统地方特色盐淹渍砂仁入药或者砸成碎末作为调料，具有较高药用价值，用于治疗腹痛痞胀、脾胃气滞、噎膈呕吐、寒泻冷痢、妊娠胎动等证；也常与家禽、鲫鱼一起煲汤佐餐，或者砂仁泡酒，均是闽南地区备受欢迎的营养食谱。

经考证鉴定福建省漳州市长泰县种植的砂仁是从广东省阳春县引种而来的阳春砂（Amomum villosumLour.），长泰县种植砂仁有100多年历史，是福建省最大的砂仁种植地，也是福建省砂仁主流品种。砂仁是姜科豆蔻属多年生草本植物。果实供药用，味辛，性温，归脾经、胃经、肾经［1］。砂仁含有黄酮类成分，主要为槲皮苷［2］。中医认为砂仁具有治疗脾胃气滞、宿食不消、腹痛痞胀、噎膈呕吐、寒泻冷痢的功效，现代药理研究表明砂仁具有抗溃疡、抗腹泻、促进胃排空和胃肠推进运动、利胆、镇痛、抗炎、抗血小板聚集和延长凝血时间等作用［3-5］。黄酮类化合物广泛存在于植物中，具有非常显著的抗氧化和杀菌等效用，是一种天然的抗氧化剂［6］。槲皮苷除具有抗氧化作用外，对结肠炎症具有治疗作用［7］，还对结肠癌细胞、肺癌细胞具有抗增殖和凋亡作用［8-9］。

目前关于长泰砂仁总黄酮相关研究报道较少，王文杰等［10］采用浸提法对砂仁中总黄酮提取进行正交优化，李宗主等［2］对阳春砂仁的总黄酮进行提取测定。目前常用于黄酮类化合物的提取方法为有机溶剂提取法，乙醇作为常用的提取溶剂被广泛应用。响应面法用于中药材中总黄酮的提取优化也有较多的应用［11-12］。本实验通过单因素试验考察提取方法、提取时间、提取溶剂、料液比和提取次数对长泰砂仁总黄酮提取率的影响，并以槲皮苷标准品的提取结果为参照进行对比，研究长泰砂仁黄酮类成分的最佳提取工艺，为长泰砂仁黄酮类物质的有效利用和拓展其药理价值提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料长泰砂仁，购自漳州市长泰县益康药房，经漳州卫生职业学院王小平教授鉴定为姜科植物阳春砂（Amomum villosumLour.）的干燥果实；槲皮苷（111538-200504）购自中国食品药品检定研究院；无水乙醇、氯化铝、三乙胺、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠购自国药集团化学试剂有限公司，水为超纯水。

1.2 仪器UV-1800紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；AR224CN万分之一电子天平（常州奥豪斯仪器有限公司）；KQ-500DE超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 对照品溶液配制精密称取槲皮苷标准品5.00 mg置50 mL容量瓶中，加80 %乙醇溶液定容至刻度，得到浓度为0.1 mg/mL的对照品储备液。

2.1.2 供试品制备将新鲜长泰砂仁挑去杂质，置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，过80目筛。取适量粉末，加入一定比例体积分数的乙醇溶液，混合均匀，相应提取方法提取一定时间，提取液滤膜过滤得到供试品溶液。

2.2 方法学考察与含量测定

试验分别设在甘州区党寨镇陈寨村中种集团张掖种业有限公司玉米制种基地，海拔1 509 m、东经101.12°、北纬38.6°；临泽县平川镇三二村甘肃临泽奥瑞金种业有限公司玉米制种基地，海拔1 369 m、东经99.85°、北纬39.4°。前茬作物均为制种玉米，供试土壤为灰灌漠土，地块平整，肥力中等，灌溉设施配套齐全。

2.2.1 标准曲线绘制分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0 mL槲皮苷对照品溶液置5 mL量瓶中，各加入2 %三氯化铝1 mL，80 %乙醇定容，摇匀，显色10 min后立即在400 nm波长处测定吸光度。所得数据经回归处理得到槲皮苷浓度与吸光度之间具有良好的线性关系：Y=0.029X- 0.006 5，r=0.998 2；线性范围：4～40 μg/mL。

2.2.2 精密度试验取供试品溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，按“2.2.1”项下方法，在400 nm波长处连续6次测定吸光度，RSD值为0.02 %，表明精密度好。

2.2.3 稳定性试验取供试品溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，按“2.2.1”项下方法，在400 nm波长处测定吸光度，每10 min测定一次，60 min内RSD值为0.82 %，说明供试品显色后在60 min内稳定。

2.2.4 重复性试验取同一批次样品6份，按“2.4.4”项方法制备供试品溶液，取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法，在400 nm波长处测定吸光度，RSD值为1.23 %，表明重复性较好。

2.2.5 加样回收试验取已知含量的同一批供试品6份，每份2.5 g，精密称定，分别精密加入同量的对照品溶液，按“2.4.4”项方法制备供试品溶液，取供试品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法，在400 nm波长处测定吸光度，计算回收率，平均回收率为97.4 %，RSD值为2.84 %。

2.2.6 样品测定精密吸取按“2.1.2”项下方法制备的样品提取液1 mL于5 mL量瓶中，按“2.2.1”项下方法操作测定吸光度，计算样品总黄酮含量。

2.3 提取工艺研究

图1 提取方法对长泰砂仁总黄酮提取的影响

2.3.2 单因素试验考察

2.3.2.1 提取时间精密称取5 g长泰砂仁粉末5份，固定提取乙醇溶液体积分数80%，固定料液比为1∶10，采用回流提取法，分别提取15、30、60、90、120 min，固定提取次数为1次，按“2.2”项下方法进行总黄酮含量测定。见图2。图2显示在15～90 min范围内，提取量随提取时间的增加而增加；在90～120 min范围内，提取量随提取时间的增加而减少，即提取时间为90 min提取量最高。乙醇加入至长泰砂仁中时，溶剂浸润其细胞壁，而后缓慢渗透至细胞内，并在细胞内扩散，溶解与其极性相似的成分，从而使细胞内外产生浓度差［14］。随着时间推移，溶解的可溶性物质逐渐增多，故提取率逐渐增大。溶解进行到一定程度，溶液达到饱和，无法继续溶解黄酮类物质，甚至析出部分，其可能为90 min后提取量减小的原因。

图2 提取时间对长泰砂仁总黄酮提取的影响

2.3.2.2 提取溶剂精密称取5 g长泰砂仁粉末5份，分别加入20 %、40 %、60 %、80 %、100 %乙醇溶液，固定料液比为1∶10，采用回流提取法提取90 min，固定提取次数为1次，按“2.2”项下方法进行总黄酮含量测定。见图3。图3显示在提取乙醇体积分数20 %～80 %范围内，提取量随乙醇体积分数升高而升高；在提取乙醇体积分数80 %～100 %范围内，提取量随乙醇体积分数升高而降低。即提取乙醇体积分数为80 %时提取量最高。乙醇穿透药材细胞的能力较强，对黄酮类成分的溶解度较好。一般来说，体积分数越大溶解度越大，即提取量越大。但乙醇的极性随体积分数的增大而减小，使得对黄酮苷类成分及极性大的黄酮苷元的溶解度减小。则在一定范围内，极性对溶解度的影响小于体积分数对溶解度的影响，提取量随着乙醇体积分数的升高而升高。而超过这个范围极性对溶解度的影响大于体积分数对溶解度的影响，提取量随着乙醇体积分数的增而减小。故乙醇体积分数对长泰砂仁黄酮类成分的提取率先增大后减小。

图3 乙醇体积分数对长泰砂仁总黄酮提取的影响

2.3.2.3 料液比精密称取5 g长泰砂仁粉末6份，固定提取乙醇溶液体积分数80 %，料液比分别为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和1∶12，采用回流提取法提取90 min，固定提取次数为1次，按“2.2”项下方法进行总黄酮含量测定。见图4。图4显示料液比为1∶8时提取量最高。长泰砂仁中总黄酮的含量呈现先升高后降低的趋势，这可能是因为料液比较小时，有效成分无法充分溶入乙醇中，同时较高体积分数的乙醇会破坏黄酮类化合物的结构；而料液比较大时，虽然溶解度大，但乙醇易挥发，料液比随着提取过程的进行而不断减小，综合整个过程实际料液比减小。则在一定范围内，提取溶剂量越大，总黄酮的提取量越大，达到一个峰值。而超过这个范围，提取量不断减小。料液比和损失量对实验的影响处于一个动态平衡。

图4 料液比对长泰砂仁总黄酮提取的影响

2.3.2.4 提取次数精密称取5 g长泰砂仁粉末2份，固定提取乙醇溶液体积分数80 %，固定料液为1∶8，采用回流提取法，提取3次，每次提取90 min。按“2.2”项下方法进行总黄酮含量测定，结果见图5。图5显示总黄酮提取量随着提取次数的增加而增加，但提取2次与提取3次的含量差异不大，因此提取2次最佳。

图5 提取次数对长泰砂仁总黄酮提取的影响

2.4 响应面优化试验

2.4.1 试验设计根据单因素试验得出的最佳提取条件：回流提取、提取时间为90 min 、乙醇体积分数为80 %、料液比为1∶8、提取次数为2次。固定提取次数为2次，选择影响提取工艺的因素提取时间（A）、乙醇体积分数（B）、料液比（C），根据 Box-behnken 试验设计原理设计三因素三水平试验，因素及水平编码表见表1-2。

表1 响应面试验因素水平编码表

表2 Box-Behnken试验设计与结果

2.4.2 模型的建立及显著性检验：以长泰砂仁中总黄酮含量为响应值，采用Design-Expert.V8.0.6软件对表3的结果进行回归分析，得到综合评分对提取时间（A）、乙醇体积分数（B）、料液比（C）的二元多项回归模型为Y=-6.517 5+0.033 042 A-0.071B+1.274 38C-3.33×10-5AB-1.25×10-4AC-5.2×10-18BC-1.9×10-4A2-4.718×10-4B2-0.072 8C2，回归方程及各影响因素的ANOVA分析见表3。

表3 回归方程的显著性检验及方差分析

由表3回归方程的显著性检验及方差分析可知，F模型=436.19，且P<0.000 1，表明该模型对提取工艺具有极显著的影响。失拟项P=0.835 9>0.05，表明无明显失拟因素存在，数据没有异常点。因此可用该回归方程分析和预测长泰砂仁总黄酮的最佳提取工艺条件。由表3可以看出二次项A2、B2、C2和一次项A、B、C的P值均<0.000 1，说明二次项A2、B2、C2和一次项A、B、C对综合评分的影响都是极显著的；其余各项的P值均大于0.05，对综合评分没有显著影响。提示各影响因素与长泰砂仁总黄酮提取率之间并非简单的线性关系。从表3中可以看出，单因素A、B、C的F值大小分别为493.93、519.59、889.40，提示单因素对长泰砂仁中总黄酮的提取率影响顺序为C>B>A。

2.4.3 响应面分析依据回归模型作出相应的响应曲面图，分析各考察因素对长泰砂仁总黄酮含量的影响。见图6-8。由图可知，根据拟合模型方程可知，AB、BC和AC之间不显著，即交互作用较弱，表现为曲面平滑。当料液比一定时，总黄酮得率均随提取时间或乙醇体积分数的增加而先增大后减小，但是等高线变化幅度较小，说明总黄酮得率变化幅度不大；当提取时间或者乙醇体积分数固定时，其他两个变量对总黄酮提取率的影响均为先增后减，且变化幅度较弱。通过软件Design-Expert. V8.0.6对模型求解得长泰砂仁中总黄酮提取最优工艺条件为：提取时间77.61 min，乙醇体积分数72.49 %，料液比1∶8.68（g/mL），总黄酮达到最大值2.872 mg/g。

图6 乙醇体积分数和提取时间的响应面图

图7 料液比和提取时间的响应面图

图8 乙醇体积分数和料液比的响应面图

2.4.4 验证试验考虑到实际操作的可行性，调整工艺参数为：提取时间77.6 min、乙醇体积分数72.5 %、料液比1∶8.7（g/mL）、回流提取2次。在此最优提取工艺条件下进行3次平行验证试验，计算出长泰砂仁中总黄酮的平均提取量为2.85 mg/g。与预测值的偏差为0.70 %，表明优选的工艺条件准确可靠、合理可行。同时采用王文杰等［10］和李宗主等［2］关于砂仁总黄酮的提取方法对同一批次砂仁进行总黄酮含量测定，结果王文杰等的方法测定为2.45 mg/g，李宗主等的方法测定为2.57 mg/g，本文优化的提取方法总黄酮含量更高，且提取时间更短。

3 讨论

为了优选长泰砂仁提取工艺，首先对长泰砂仁总黄酮的含量测定方法进行选择，查阅文献，关于砂仁总黄酮的含量测定方法已有报道，主要包括氢氧化钠-亚硝酸钠-硝酸铝显色法［13-14］，氯化铝显色法［15］，以及使用不显色258 nm下单一波长检测法［2］，而经过考察本次研究的长泰砂仁原液不显色，干扰较大，无法使用单一波长检测法，同时对比了显色方法：氢氧化钠-亚硝酸钠-硝酸铝显色法、氯化铝显色法以及2015版《中国药典》总黄酮测定也常用的三乙胺显色法，参考范世明等［16］文献，发现氯化铝法在400 nm处吸光度最高，并且根据砂仁黄酮成分研究和含量测定，其含量最高的成分为槲皮苷［2］，以槲皮苷为对照的，考察氯化铝用量（0.5 %、1 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %、12 %、16 %、20 %），确定2 %氯化铝溶液为最优显色条件，与庞晓晗［15］结果一致，采用该方法应用于工艺的结果评价。

关于长泰砂仁响应面优化工艺的研究中，通过单因素考察提取时间、液料比和乙醇体积分数对长泰砂仁总黄酮提取优选的基础上，运用Box-Benhnken的中心组合设计原理，分析各单因素对长泰砂仁总黄酮提取率的影响，并模拟回归方程及方差结果显示，提取时间、液料比和乙醇体积分数、液料比的二次方项、提取时间的二次方项和和乙醇体积分数的二次方项对长泰砂仁总黄酮提取率的影响具有显著性，各单因素影响长泰砂仁总黄酮提取的顺序为料液比>乙醇体积分数>提取时间，采用响应面法确定最佳的单因素水平为回流提取，优化得到长泰砂仁总黄酮最佳提取条件为乙醇体积分数72.5 %，料液比1∶8.684、提取时间77.61 min、提取次数为2次。通过精密度试验、稳定性试验、重复性实验和加样回收试验，确定该提取工艺准确、稳定、简单，为长泰砂仁总黄酮的提取开发奠定基础。