自噬与非酒精性脂肪性肝病调控相关因子的关系

赵佳鹤，马欣雨，徐敬娅，段婷婷，张春蕾，李宝龙

1 黑龙江中医药大学 药物安全性评价中心，哈尔滨 150040；2 黑龙江中医药大学 佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154000

1 自噬

20世纪50年代比利时科学家Chirstian deDuve发现了溶酶体，之后在对大鼠肝细胞溶酶体的研究中发现溶酶体中存在大量的包裹细胞器的吞噬泡，并用自噬对这种现象命名[1]。东京工业大学大隅良典教授利用酵母细胞展开了一系列关于自噬的研究，发现了30多个自噬关键基因(autophagy related gene，ATG)，并于2016年获得了诺贝尔生理学奖或医学奖。自噬是细胞中稳定存在的自我降解机制，通过自噬途径可以降解细胞中衰老死亡的细胞器、错误折叠的蛋白质以及其他分子，促进了胞内物质的重新利用并为细胞生存提供能量。细胞自噬根据底物运送机制的不同主要分为3种形式：微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬 (chaperone-mediated autophagy，CMA)[2]。哺乳动物细胞中存在的自噬包括巨自噬和CMA。巨自噬主要包括自噬泡的出现、自噬泡包裹降解底物形成自噬体、自噬体与溶酶体结合降解底物3个过程[3]；CMA是依靠热休克蛋白直接携带降解底物至溶酶体降解的过程[4]。

自噬是人体中重要的保护机制，通过抵抗氧化应激发挥细胞保护作用[5]，而人体机能的衰退以及疾病的产生也与自噬受损有关。心血管疾病、神经退行性病、肿瘤的发生发展[6-8]等都与自噬功能受损有关。在肝脏疾病与自噬的相关研究进展中发现，自噬与病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、急性肝损伤、药物性肝损伤、肝纤维化、肝癌都有关联[9]。因此，自噬途径(激活或抑制自噬)可能成为相关疾病治疗的新策略。

2 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

NAFLD是指以代谢异常为主要致病因素的脂肪性肝病，目前国际专家共识建议将其命名改为代谢相关脂肪性肝病，其诊断主要包括超重或肥胖、2型糖尿病、体型较瘦或体型正常但伴有代谢紊乱[10]。脂肪性肝病的发病原因主要为肝细胞中的脂质沉积过度引起脂肪变性[11]，进一步发展可以成为肝纤维化、肝硬化以及肝细胞癌。我国NAFLD发病率在13%～43%，且每年新增患病人数在4%左右[12]。NAFLD是心血管疾病、糖尿病等的重要危险因素[13]。根据精准医疗的观点，目前尚无有效的专门治疗药物，探讨NAFLD的发生机制就显得尤为重要。

3 自噬与NAFLD的关系

自噬除了可以降解蛋白质、细胞器之外，还可以降解细胞中的脂质，通过自噬途径选择性降解细胞中脂质的生理过程称为“脂噬”[14]。脂噬作为一种特殊类型的自噬，扮演着维持细胞内的脂质平衡的角色[15]。这一发现带来一个新的思路，是否可以通过自噬的途径减轻细胞内的脂肪堆积，缓解脂质代谢紊乱。

3.1 自噬与NAFLD的发生发展 在NAFLD发生的早期阶段肝脏中自噬处于增强状态，随着疾病进展到后期阶段自噬逐渐被抑制。自噬通量分析结果也表明自噬合成与降解发生于早期，随着时间推移而逐渐被抑制[16]。由于肝细胞内脂质的蓄积得不到有效控制才会由单纯性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化进展。这一结果恰恰与自噬活性的改变有关，表明自噬可能参与肝细胞脂肪变性的进展。

3.2 自噬与脂肪滴(LD)的降解 NAFLD的主要病理表现是肝细胞中LD的大量蓄积引起脂肪变性，研究[17]表明降解LD可以依靠自噬途径。临床以及实验研究发现脂肪变性的肝脏中CMA的功能受损。Plin5参与调节细胞脂滴内中性脂肪的合成及分解，在机体脂质代谢平衡中发挥核心作用[18]。Plin5既是CMA的特异性底物又是LD降解的前提，CMA诱导的Plin5降解的中断阻碍了LD的分解[19]。另一方面，最终降解脂滴依靠自噬体的产生，而自噬体表面覆盖的磷脂的缺乏似乎限制了自噬的进程。磷酸胆碱胞苷转移酶β3(CCTβ3)是细胞中磷脂合成的限速酶，在饥饿诱导的长时间自噬存在的研究中发现，磷脂只聚集在细胞内结合了CCTβ3的脂滴周围，而这种脂滴是由细胞内降解后产生的脂肪酸再形成的，参与构建新的自噬体，这一点与外源性脂肪酸存在无关[20]。这可能解释了NAFLD中自噬活性降低可能与外源性脂肪酸不断摄入，自身的脂质分解受阻不能产生自噬所需的膜磷脂有关。

4 自噬与NAFLD调控因子的相关性研究

4.1 自噬与NAFLD炎症进展相关因子

NAFLD的发生发展归因于能量代谢稳态的失衡，这其中涉及能量感受器的变化以及脂质代谢调节因子的表达水平变化。因此，自噬与NAFLD的内在联系就可以从能量调节以及蛋白表达调控两方面入手，这包括腺苷酸磷酸化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、脂质代谢调节因子以及非编码RNA等。

4.1.1 AMPK AMPK是机体内能量代谢的枢纽，被称为机体能量感受器，既感受着细胞内能量的变化又可以调节下游自噬关键蛋白的活化。

AMPK通路是维持线粒体健康的关键因素，通过调控线粒体的融合避免线粒体损伤[21]，而线粒体功能障碍又是NAFLD中脂肪酸分解速率减慢的重要因素。线粒体蛋白电压依赖性离子通道1(VDAC1)可以调节细胞中AMPK/mTOR信号转导[22]，在NAFLD的进展中发现，VDAC1介导的线粒体膜脂质成分中心磷脂的转移导致线粒体功能障碍[23]，而这一原因也是加剧NAFLD向肝癌发展的重要因素。线粒体功能障碍，其中的脂肪酸β氧化也受到抑制，胞内AMP/ATP比值升高可以激活AMPK途径启动自噬，修复线粒体损伤。石斛合剂可通过活化AMPK提高自噬相关蛋白转录因子EB、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)的表达，激活自噬，逆转高糖高脂对肝细胞的损伤[24]。

Lu等[25]通过比较高脂饮食诱导的野生型小鼠和载脂蛋白E(ApoE)基因敲除鼠的血脂、肝损伤程度、自噬相关蛋白活性，发现基因敲除鼠的血脂和肝损伤程度明显增加，自噬相关蛋白明显下调。加入AMPK后，相关的病理表现和蛋白表达情况得到恢复，表明ApoE可能参与AMPK的活化，ApoE的缺乏通过抑制AMPK-mTOR途径抑制自噬过程，导致肝脂质水平和损伤程度明显增加。Wu等[26]发现熊去氧胆酸(UDCA)可使B细胞淋巴瘤因子-2/Bax和B细胞淋巴瘤因子-2/Beclin1蛋白复合物解离，抑制细胞凋亡和改善自噬，改善肝脂肪变性。当加入AMPK抑制剂后，其作用效果抵消。这表明UDCA是通过激活AMPK进而使复合物解离，达到抑制肝细胞凋亡、改善细胞自噬、减轻肝脂肪变性的目的。苹果多酚(APE)是一种天然制剂，可以有效缓解复合脂肪酸诱导的HepG2细胞中脂质沉积，其主要作用包括增强自噬活性、恢复溶酶体酸化、抑制脂质合成并可轻度促进脂肪酸氧化。进一步的研究[27]发现，APE通过上调沉默调节蛋白1的表达，激活肝激酶B1/AMPK途径，抑制下游mTOR的信号传导，启动自噬，从而有效缓解脂肪酸诱导的脂质积累。

4.1.2 脂质代谢调节因子

脂质代谢调控因子，如法尼醇X受体(FXR)与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α、碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)与PPARγ、Smad泛素化调节因子1(Smurf1)与固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)等，主要负责脂质的合成或分解过程，正常人体中脂质变化处于动态平衡，在这种情况下不会出现脂质过度蓄积。受环境因素、饮食因素、外界损伤因素等，脂质稳态遭到破坏，相应的代谢调节因子的表达水平发生异常就会出现脂质代谢紊乱。因此，通过研究脂质代谢调控因子在脂代谢中如何发挥作用就可以达到缓解脂肪变性的目的。

4.1.2.1 FXR与PPARα 肝脏中LD大量积累的原因在于脂肪酸的合成与代谢稳态遭到破坏。PPARα和FXR属于核受体，在体内脂肪酸的代谢中具有交互作用，前者参与脂肪酸氧化进程，为机体提供能量；后者抑制脂肪酸的合成，避免其在细胞内的堆积[28]。进食状态下FXR被激活，肝脏自噬处于抑制状态，FXR基因敲除后自噬增强。禁食状态下PPARα被激活，自噬增强，敲除PPARα基因，自噬受到抑制。可见自噬的表达也受细胞内脂代谢调控因子的调控[29]。

4.1.2.2 ChREBP与PPARγ ChREBP具有恢复外界刺激引起的肝细胞ATP稳态受损的作用，这一过程涉及到ChREBP转录水平的增加以及AMPK的活化[30]。高碳水化合物饮食通过提高ChREBP与PPARγ启动子区的DNA结合能力，促进PPARγ的转录，显著增加肝细胞脂质积累诱发NAFLD产生，同时激活自噬[31]。PPARγ既是脂质代谢的关键因子，又是自噬的激活因子。PPARγ的表达增加可以检测到LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和AMPK的活化水平均升高；抑制PPARγ的表达后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和AMPK的活化水平均降低，表明PPARγ可以通过自噬缓解脂质堆积并降低总胆固醇[32]。

4.1.2.3 Smurf1与SREBP-1c Smurf1的缺失可以减少肝细胞中脂滴和甘油三酯的积累，SREBP-1c 是介导脂肪从头合成的关键转录因子，Smurf1通过阻止SREBP-1c与泛素E3连接酶FBW7A结合，保护SREBP-1c免受泛素化和降解，参与肝细胞中脂质的积累过程[33]。动物实验表明SREBP-1c可能通过抑制自噬功能参与大鼠NAFLD发生。因此Smurf1的作用在于通过防止SREBP-1c被降解，进而抑制自噬，导致脂肪变的发生[34]。

4.1.3 非编码RNA

非编码RNA是细胞中不参与基因编码的RNA片段，但是操控着基因从转录到翻译的过程。根据RNA片段大小可以分为小分子RNA和长链非编码RNA两大类，脂质代谢调节因子的表达水平的变化受到非编码RNA的调控。在脂质代谢调节过程中，非编码RNA既可以调节脂质代谢关键蛋白，又可以调节自噬相关蛋白的表达水平。因此非编码RNA可能作为一个枢纽参与自噬过程和肝脂肪变性的调节。

4.1.3.1 转运RNA片段(tRNA Fraction，tRF)-3001b tRF是来源于tRNA前体的小分子非编码RNA片段，其中一部分tRF 通过作为miRNA发挥其生物功能。自噬生长阻滞信号通过诱导tRNA半分子(tRF的一种类型)降解和回收闲置的蛋白质。有研究[35]表明，tRFs有抵抗肝脂肪变性的作用。Zhu等[36]研究发现tRF-3001b是病理状态下小鼠肝组织中变化最为明显的tRNA片段，通过沉默tRF-3001b发现，脂质合成减少，自噬表达增加。在此基础上加入自噬抑制剂，结果与之相反，表明tRF-3001b对脂质合成的影响是依赖于自噬途径。进一步研究tRF-3001b与自噬关键基因的关系发现，tRF-3001b是通过靶向抑制自噬相关基因Prkaa1的表达，促进脂质的形成，参与肝脂肪变性进程。

4.1.3.2 microRNA(miR)-188 miRNA是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子，在动植物中参与转录后的基因表达的调控。功能主要包括促进缺氧诱导损伤和调控自噬与凋亡[37-38]。miR-188作为miRNA的一种类型，具有促进癌症发生发展、加重细胞凋亡程度、缓解神经退行性疾病、调节与年龄相关的脂肪细胞的分化等功能[39-42]。Liu等[43]研究发现miR-188可以在肝脂质代谢中起到负调控作用。在高脂饮食诱导的小鼠肝脏中，过表达miR-188可以加重肝脂肪变性和胰岛素抵抗；抑制miR-188可以起到缓解的效果。其中miR-188在糖脂代谢中作用的发挥依靠自噬途径，ATG12是其作用发挥的靶向基因。miR-188通过靶向抑制自噬相关基因ATG12的表达，阻碍肝脏自噬进程，进而加重了肝脂肪变性以及胰岛素抵抗效果。

4.1.3.3 结肠癌相关转录因子1 肝X受体(liver X receptor，LXR)是一种配体依赖的转录因子，调控着脂类、胆固醇等的代谢与稳态。hsa-miR-613在LXRα的自动调整中发挥着重要作用，通过靶向LXRα的3′端非转录区，调控内源性LXRα的表达情况[44]。长链非编码RNA结肠癌相关转录因子1作为与miR-613竞争的内源性RNA以LXR反应元件依赖性的方式，抑制miR-613增加LXRα的转录，促进肝脏中脂滴的形成和NAFLD的发生[45]。LXRα是let-7a和miR-34a的转录因子，ATG4B和Rab-8B参与自噬体和自噬溶酶体的形成，LXRα通过诱导let-7a和miR-34a的表达下调ATG4B和Rab-8B的水平，抑制自噬，从而引起线粒体中的氧消耗量和线粒体跨膜电位的降低即线粒体损伤，最终引起肝脂肪变性[46]。

4.2 自噬与NAFLD纤维化进展相关因子

NAFLD所导致的炎性反应如果得不到有效的遏制就会继续向肝纤维化进展，而肝纤维化也是肝损伤的一种常见病理表现。在缓解肝纤维化方面自噬也起到了重要的参与作用。肝纤维化的产生与许多蛋白表达有关，而这些蛋白多是通过损伤自噬发挥促纤维化作用，其中包括骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和环氧化物酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等。靶向促纤维化关键蛋白可以有效减慢肝脂肪变性进程，发挥肝细胞保护作用。

4.2.1 OPN OPN是细胞外基质蛋白，具有促纤维化的作用，与NAFLD的发病密切相关。研究[47]表明，OPN通过与受体结合素αVβ3和αVβ5结合抑制NAFLD小鼠模型中自噬体与溶酶体的结合，损伤自噬。抗OPN治疗可以有效缓解肝脂肪变性以及自噬损伤。

4.2.2 COX-2 COX-2过表达引起的炎症可以诱导纤维化的产生，在NAFLD中COX-2的水平也发生了改变[48]。NS398是COX-2的抑制剂，可以诱发自噬的产生[49]，表明COX-2对自噬具有抑制作用。COX-2引起的肝细胞损伤的加剧可能与抑制自噬有关。

5 小结

AMPK、脂代谢调控因子、非编码RNA等既参与肝脏中的脂质代谢过程又参与了自噬关键蛋白的调控，这些NAFLD调控的相关因子可以通过自噬途径缓解肝脂肪变性。此外，借助自噬的方法也可以使某些蛋白表达下调，阻止肝脂肪变性向肝纤维化进展。因此，自噬与NAFLD具有明显的相关性，通过靶向相关因子改善自噬可以达到缓解肝脂肪变性的目的。随着人们对NAFLD的深入了解，一系列的关键机制将会被发现。自噬作为进化中高度保守的存在也将会在NAFLD的精准治疗中发挥作用。自噬在NAFLD中由激活变为抑制，这个临界状态可能是临床治疗的一个关键时间点。同时，自噬介导的肝脏中脂质降解产物的后续代谢过程也是不可忽视的问题。此外，自噬作为一把双刃剑，如何更加充分有效发挥它的有益功能也是需要解决的问题。因此，自噬在NAFLD中发挥作用的研究仅仅是一个开始，仍需深入研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：李宝龙、赵佳鹤负责课题设计，资料分析，撰写论文，修改论文；马欣雨、徐敬娅、段婷婷参与收集分析文献资料；李宝龙、张春蕾负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。