RNA N6-甲基腺苷修饰的研究方法综述

刘飞燕

武汉大学生命科学学院 湖北 武汉 430072

引言

RNA是遗传信息传递的重要一环，具有非常重要的生理功能。近年来发现RNA上的修饰对于RNA的功能具有关键的调控作用。m6A是腺嘌呤（A）第6位氮原子处发生甲基化形成的修饰，该修饰广泛存在于mRNA和非编码RNA上，是mRNA上最普遍的修饰[1]。mRNA的修饰过程发生在细胞核中，其被甲基转移酶复合物甲基化形成m6A，甲基转移酶复合物被称为m6A的编写器，包括异源二聚体甲基转移酶样3-甲基转移酶样4（METTL3-METTL14）催化核心，还有肾母瘤细胞1相关蛋白（WTAP）、KIAA1429蛋白、RNA结合基序蛋白15（RBM15）及其旁系同源物RBM15b、锌指蛋白ZC3H13等。然而，m6A修饰是一个动态可逆的过程，它也可以被FTO、ALKBH5等的脱甲基酶（擦除器）去除[2]。能够识别并结合m6A修饰的蛋白被称为m6A的阅读器，现在已鉴定到的阅读器包括最早发现的YTHDF1，YTHDF2，YTHDF3，还有细胞核蛋白YTHDC1，HNRNPC，HNRNPG，HNRNPA2B1，核质共存蛋白YTHDC2，以及细胞质中的IGF2BPs，FMR1等，这些阅读器蛋白可以调节mRNA的几乎整个生命周期，包括翻译、降解、剪接、出核、结构开关等[3-4]。m6A通过其编写器、擦除器、阅读器调控着细胞的各个生命过程，对肿瘤发生、癌症细胞凋亡、细胞分化、细胞周期、昼夜节律、精子发生等都有影响[5]。

自20世纪70年代首次发现m6A，在长达半个世纪的过程中，对m6A的研究一直处于相对停滞的状态，原因是缺乏有效检测m6A的方法，随着生命科学技术的发展，尤其是高通量测序时代的到来，m6A的检测方法越来越丰富，对m6A鉴定的准确性也越来越高，接下来，我将按照实验方法的技术特点对几种主要的m6A检测方法进行简要概述。

1 定性方法

1.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）应用非常广泛，其相对于柱色谱（LC）技术的改进主要是由低压玻璃柱换成了高压金属柱，提高了检测效率。1974年，Desrosiers等人在放射性标记的Novikoff肝癌细胞中纯化了mRNA，利用液相色谱法首次发现了mRNA上的m6A修饰，后续长达几十年几乎都用此方法对m6A进行研究[6]。基本原理为首先利用酶消化mRNA并纯化，将其解离为不同的RNA核苷组分，各组分依次经过色谱柱及检测器，检测器将各组分的生物信号转换为电信号输出得到色谱图，通过与标准品的比较，鉴定各种组分。HPLC由于在分析之前对RNA进行了处理，可能会改变原始RNA结构，但是该方法操作简单、成本低，可有效定性检测RNA的m6A修饰，至今仍然被广泛使用。

1.2 MeRIP-seq

高通量测序技术的发展为m6A检测方法的研究开辟了新道路，Meyer等人将m6A特异性甲基化的RNA免疫沉淀技术与高通量测序技术相结合，开发了用以检测m6A在转录组上位置信息的MeRIP-seq方法[7]。该方法首先对总RNA进行RiboMinus处理以去除核糖体RNA，然后将其打断成小片段，利用特异性结合m6A修饰的抗体与磁珠耦联，再将磁珠与RNA进行孵育，从而捕获具有m6A修饰的RNA片段，最后进行高通量测序。需同时进行对照组实验以消除免疫沉淀过程中的背景，对得到的测序数据分析后，得到转录组中m6A位点信号。现已发现m6A主要存在于mRNA的编码区（CDS）及3‘非翻译区（3’UTR），在内含子和5‘非翻译区及基因间也存在少量修饰，其在终止密码子区域具有一个强烈的富集信号。MeRIP-seq由于其可高通量获得m6A的位置信息，现已成为研究m6A机制和功能的主要方法之一。

1.3 MiCLIP

MeRIP-seq可将m6A修饰定位于mRNA上的100-200nt的区域内，仍无法精准定位到单个碱基，为了检测到mRNA上m6A的精确位置，Linder等人开发了m6A单核苷酸分辨率交联和免疫沉淀方法（miCLIP）[8]。该方法基于紫外线（254nm）交联特异性结合m6A的抗体和RNA，并在反转录时产生特征性突变，从而鉴定m6A的精确位置。一种特征性突变为Abcam抗体以高度位置特异性诱导的m6A共有基序“DRACH”中的C突变为T，另一种为SySy抗体在m6A的+1位诱导的cDNA截短，前者可以对单个或者成簇的m6A位置进行精准定位，后者可以同时检测m6A修饰以及新型RNA修饰m6Am。MiCLIP方法不需要对细胞进行预处理，得到的结果可靠，已越来越多地应用于对m6A的研究。

2 定量方法

2.1 斑点印记技术

斑点印记技术不仅可以用来定量检测m6A修饰，还可以检测DNA，RNA和蛋白质，其与蛋白印记（western）技术原理类似，但是操作更为简单，效率更高[9]。斑点印记技术首先需要在提取细胞总RNA后纯化poly(A) RNA，接下来无须进行聚丙烯酰胺电泳步骤，可直接使用Bio-Dot微滤装置（Bio-Rad）将纯化后RNA样品滴加到尼龙膜上形成圆点，然后用UV照射交联，后续的脱脂奶粉封闭、孵育洗涤一抗二抗、放射自显影等步骤皆与western技术类似，最后可利用Media Cyber netics等软件对每个点的相对信号密度进行检测，从而定量m6A修饰[10-11]。该方法可以验证m6A的存在，也可以比较不同样品之间m6A修饰的量，但是并不能对单个样品进行精确定量。斑点印记技术是初步定量m6A的基础方法，由于其成本低，易操作，重复性好等优点，已成为验证m6A的主要方法之一。

2.2 电化学免疫传感器方法

为了更简单又灵敏地定量检测生物样品中的m6A，Yin等人开发了一种电化学免疫传感器的方法，该方法以N6-甲基腺苷5’-三磷酸（m6ATP）作为检测目标分子[12]。具体检测策略为：先制备用以放大信号的银纳米颗粒和带有胺-聚乙二醇3-生物素的SiO2纳米球（Ag @ SiO2），该纳米复合材料会被链霉亲和素捕获。然后依次将玻碳电极（GCE）、石墨烯-AuNPs（GR-Au）、MPBA、抗m6A抗体、生物样品（含m6ATP）、磷酸标记的生物素、链霉亲和素、Ag @ SiO2连接，制备生物传感器。最后将生物传感器浸入硝酸溶液中，根据Ag氧化的电流信号得到m6A浓度的生物信号，从而对生物样品进行m6A定量检测。电化学免疫传感器方法便捷、成本低、特异性强、灵敏度高，已对多种人细胞系实现了高精度m6A检测。

2.3 m6A-LAIC-seq

同一个基因的不同转录本上的m6A修饰不尽相同，特定基因的甲基化转录本与非甲基化转录本的比例称为m6A水平，不同转录本m6A水平的检测对于m6A与转录本的功能研究具有重要的参考意义。m6A水平和亚型特征测序（m6A-LAIC-seq）是检测转录组m6A水平和转录本亚型的主要方法，与MeRIP-seq不同，该方法在进行poly(A) RNA纯化后，不会将RNA片段化，抗m6A抗体可以捕获到完整的全长转录本，将m6A阳性的转录本与m6A阴性的转录本进行测序后，通过计算得到不同转录本的m6A水平及亚型信息[13]。m6A-LAIC-seq虽然不能定量单个核苷酸的甲基化修饰，但可以定量分析每个基因中的m6A水平，又由于其特异性好，灵敏度高，重复性好，因此成为检测m6A的主要方法之一，对m6A与转录本的定量研究提供了新的视角。

3 结束语

对RNA上m6A的检测及功能的研究是近年来兴起的研究领域，由于m6A在RNA的广泛存在，其功能复杂且重要。随着m6A阅读器蛋白的发现，m6A修饰的下游分子机制也逐渐受到关注，但是由于检测方法的限制，仍有许多功能机制尚不清楚。除了上文阐述的m6A的几种检测方法，还有薄层色谱分析法、MazF RNA核酸内切酶定量分析法等也是检测m6A的常用方法，这些方法存在着局限性，例如无法对数量稀少的样本进行检测，无法精确定量每个RNA上的m6A修饰数量[14-15]。三代测序技术（SMRT技术和纳米孔测序技术）的发展可以逐渐弥补这些局限，其可以对原始全长RNA进行直接测序，但由于三代测序技术仍不够成熟，还存在准确度不够高，通量不够大的问题。相信随着测序技术及生物信息技术的不断革新，关于m6A的功能机制将会越来越清晰。