某鸭场多种病原混合感染病例的实验室诊断

吴冬梅，金 鸿，张 霞，张人俊，刘妍罕，曾茂芹，文 明，胡安东*

(1.凯里市动物疫病预防控制中心，贵州 凯里 556000；2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008；3.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

大力发展养鸭产业是黔东南苗族侗族自治州实施乡村振兴战略的重要措施之一。2021年3月，某养鸭场从广西引进1日龄鸭苗3 000羽，21日龄时鸭群出现零星死亡病例，病鸭死亡前精神沉郁，呼吸困难，排白色或绿色稀粪，偶有淡黄色稀粪，至35日龄时死亡300余只。经调查，鸭群已免疫禽流感疫苗和鸭肝炎疫苗，病鸭曾用硫酸粘杆菌素、硫酸新霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素和磺胺药物进行治疗，但效果不明显。为查明鸭群发病死亡的原因，选取5只濒死病鸭送至贵州大学动物疫病研究所进行实验室诊断，现将诊断情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 病料采集解剖5只濒死病鸭，分别无菌采集肝脏和脾脏混合样品5份，同时观察濒死鸭各组织器官的病理变化。

1.2 主要试剂和仪器(1)试剂：鲜血琼脂培养基(贵州大学动物疫病研究所提供)；葡萄糖、乳糖、麦芽糖等16种生化鉴定管(杭州微生物试剂有限公司)；DNA/RNA提取试剂盒、DL 500 DNA Marker、DNA聚合酶等PCR检测试剂[天根生化科技(北京)有限公司]。(2)仪器：LS50HJ型立式蒸汽灭菌器(江阴市滨江医疗设备公司)、D3024R型高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)、MyCycler型PCR仪(美国Bio-Rad公司)、GenoSens 1800型凝胶成像系统(北京赛智科技公司)。

1.3 PCR引物由贵州大学动物疫病研究所提供相关病毒PCR检测引物[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.4 细菌分离鉴定

1.4.1 细菌分离培养无菌取鸭肝脏深部组织接种于鲜血琼脂培养基，37 ℃恒温培养24～48 h，观察菌落形态特征，挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征。

1.4.2 细菌生化鉴定挑取单个菌落接种于鲜血琼脂斜面培养基进行纯培养，37 ℃恒温培养24 h，挑取纯培养菌落接种于细菌生化鉴定管，37 ℃恒温培养24～48 h，进行细菌生化鉴定。需鉴别血清型的细菌则取其培养物送四川农业大学禽病研究中心进行血清型鉴定。

1.5 病毒核酸检测分别取5份濒死病鸭肝脏和脾脏混合样品，匀浆后反复冻融3次，12 000 r/min离心10 min，取上清液100 μL，用DNA提取试剂盒提取各样品总DNA，分别用鸭肠炎病毒和鸭圆环病毒特异引物进行PCR扩增；另取离心上清液100 μL，用RNA提取试剂盒提取各样品总RNA，分别用鸭肝炎病毒和新城疫病毒特异引物进行RT-PCR扩增。取各扩增产物8 μL，于1.5%琼脂糖凝胶电泳30～40 min，于凝胶成像系统下观察结果。

2 结果

2.1 病理变化由图1可见：病鸭主要病理变化为心包纤维素性炎症(3/5)，心包积液(2/5)，脾脏肿大、质脆(3/5)，盲肠臌气(2/5)。

A：心包纤维素性炎症；B：心包积液；C：脾脏肿大、质脆；D：盲肠臌气图1 病理变化

2.2 细菌分离培养鉴定结果

2.2.1 细菌培养、染色镜检5份病死鸭肝脏样品在鲜血琼脂培养基上生长出2种优势菌落：1种是边缘整齐、有光泽、透明、不溶血的白色小菌落，革兰氏染色镜检为单个或成双排列、两极着色的革兰氏阴性短小杆菌(见图2A)；另1种是中等大小、圆形、光滑、不溶血的白色或黄色菌落，革兰氏染色镜检为散在或葡萄串状排列的革兰氏阳性球菌(见图2B)。

A：革兰氏阴性杆菌；B：革兰氏阳性球菌图2 分离细菌革兰氏染色镜检(×100)

2.2.2 细菌生化鉴定(1)取革兰氏阴性菌培养物接种生化鉴定管，结果：该菌能发酵葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气；不发酵乳糖、蔗糖、甘露醇；不产生硫化氢和吲哚，不利用枸橼酸盐；M.R、V-P试验和硝酸盐还原试验阴性；氧化酶、过氧化氢酶试验阳性。符合鸭疫里默氏杆菌的生化特征，初步判定为鸭疫里默氏杆菌。经四川农业大学禽病研究中心血清型鉴定，结果为鸭疫里默氏杆菌血清2型。(2)取革兰氏阳性球菌培养物接种生化鉴定管，结果：该菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇，产酸不产气；不分解阿拉伯糖和纤维二糖；能还原硝酸盐和液化明胶；不产生硫化氢和吲哚，V-P试验和过氧化氢酶试验阳性；氧化酶试验阴性。符合金黄色葡萄球菌的生化特性，结合菌落特征和菌体形态特点，判定为金黄色葡萄球菌。

2.3 病毒核酸检测结果由图3可见：在5份肝脾混合样品中，1、3号样品检出鸭肠炎病毒特异性DNA条带(见图3A)，1、2、3、5号样品检出鸭圆环病毒特异性DNA条带(见图3B)，表明送检鸭病料组织中存在鸭肠炎病毒和鸭圆环病毒感染。未检出鸭肝炎病毒和新城疫病毒。

A：鸭肠炎病毒；B：鸭圆环病毒M：DL 500 Marker；+：阳性对照；-：阴性对照；1～5：检测样品图3 病毒PCR检测结果

3 结论

通过细菌分离培养鉴定和病毒核酸检测，结合临床症状、病理变化，确诊病例存在鸭疫里默氏杆菌、金黄色葡萄球菌、鸭肠炎病毒、鸭圆环病毒混合感染。

4 讨论

在养鸭过程中，导致雏鸭感染发病死亡的病原体较多，包括细菌、病毒和寄生虫。鸭肠炎病毒亦称鸭瘟病毒，主要侵害30日龄以上的鸭，引起鸭下痢，但近年来鸭肠炎病毒呈现感染日龄不断提前的趋势[1]。鸭圆环病毒对各种日龄鸭均可感染，单纯感染仅引起鸭发育不良、生长缓慢、饲料转化率低等现象，但对鸭造成免疫抑制，易导致鸭感染其他病原体，增加感染鸭的发病率和死亡率[2]。据相关报道，通常新城疫病毒对水禽不易致病，感染鸭一般不出现明显的临床症状，但近年来新城疫病毒感染鸭的病例较多，并发现新城疫病毒可侵害雏鸭的呼吸系统、消化系统和神经系统，引起呼吸困难、腹泻、神经症状等，造成严重的经济损失[3]。本次送检病例通过细菌分离培养鉴定和病毒核酸检测，存在鸭疫里默氏杆菌、金黄色葡萄球菌、鸭肠炎病毒、鸭圆环病毒混合感染。建议及时隔离或淘汰病鸭，加强养殖场环境消毒，同时做好健康鸭群的鸭病毒性肠炎疫苗接种，采用敏感抗生素控制细菌感染。