聚果蜈蚣藻的修订——基于形态观察、早期发育及分子序列分析

温 馨 卞 瑶 张昕陶 马 跃 王 晨 王宏伟

(1. 辽宁师范大学生命科学学院, 大连 116081; 2. 辽宁师范大学, 辽宁省植物生物技术重点实验室, 大连 116081)

蜈蚣藻属(GrateloupiaC. Agardh)是海膜科(Halymeniaceae)最大的属, 在中国共报道了36个种[1—11],广泛分布于我国暖温带、亚热带和热带沿海。该属很多种外部形态差异很大, 种的区分和鉴定很困难。 《中国海藻志》 中记载的大部分蜈蚣藻属海藻仅仅是依据外部形态所建立的新种, 很多种的分类地位还未确定。如今, 分子系统学的快速发展, 使得分子辅助的形态分类学(MAAT)逐渐兴起, 该方法也逐渐地应用于红藻分类研究上[12—14]: 2001年,Kawaguchi等[6]采用形态学和rbcL基因序列分析相结合的方法对产自意大利和亚洲的G. filicina(Lamouroux) C. Agardh进行了详细研究, 发现二者在外部形态上虽具有一定的相似性但实际上是2个独立的种, 并提出1新种, 命名为亚洲蜈蚣藻(G. asiaticaKawaguchi et Wang), 模式标本产地为日本福冈县。李芳等[15]和刘芳等16]采用形态分类学的方法对李伟新等[1]基于形态学特征建立的2个新种帚状蜈蚣藻(G. fastigiataLi et Ding)和对枝蜈蚣藻(G.didymecladiaLi et Ding)进行再鉴定, 发现这2个新种实际上分别是亚洲蜈蚣藻和亚栉状蜈蚣藻(G.subpectinata)的同物异名。由此可见, 在藻类分类学的研究中, 分子分析手段的加入, 可以来验证经典分类学的准确性, 为海藻分类学中已知种的鉴定提供了重要依据。

本研究的聚果蜈蚣藻(G. sorocarpusLi et Ding)记载于《中国海藻志》(2004)第二卷第三册中[1],对该种的描述为: 藻体主枝较硬, 小羽枝一般密集在分枝中部, 小枝棍棒状或扁平, 基部缢缩, 髓丝交接处呈哑铃状, 成熟囊果聚集在一起呈瘤状, 是由李伟新等[1]基于囊果的形态及分布状态等简单的形态学特征对采自中国山东省青岛市的雌配子体进行研究并建立的新种。为了验证仅依据简单的外部形态而提出的聚果蜈蚣藻的分类地位是否可靠,有必要对其形态、结构、孢子发育类型和基因序列分析进行详细的研究, 将聚果蜈蚣藻的分类地位进行重新鉴定。研究结果将明确聚果蜈蚣藻的分类学地位, 为蜈蚣藻属海藻的早期发育过程提供更详细的信息并对中国的蜈蚣藻属海藻的修订和重新分类提供有力依据。

1 材料与方法

1.1 材料的采集、处理及观察

标本的采集: 2018年5月至2019年5月期间分多次进行聚果蜈蚣藻的采集, 采集地点位于模式标本产地山东省青岛市的第一海水浴场(120°20′30.275″E, 36°3′27.202″N)、麦岛(120°23′46.644″E,36°18′26.784″N)和鲁迅公园(120°19′58.555″E,36°3′17.096″N)的低潮带礁石上或石沼中(表 1)。

表1 聚果蜈蚣藻的采集地点、标本编号和基因登录号列表Tab. 1 Sampling locations, specimen numbers and gene accession numbers of G. sorocarpus

标本的处理: 将采集后的样本去除附生藻类等杂质并进行编号, 选择具有成熟囊果的新鲜活体标本保存于恒温箱中空运回实验室用于早期发育及生活史研究; 选择形态完整的样本制作成腊叶标本、液浸标本和硅胶干燥标本, 分别用于制作冰冻切片观察内部结构及提取DNA进行分子分析。

标本的观察: 样本的外部形态、内部结构及早期发育过程分别使用解剖镜和Olympus BX53荧光显微镜进行观察。

1.2 早期发育研究

将采集到的样本进行筛选和分类选择新鲜的、生长状态良好的、完整的四分孢子体和具有成熟囊果的雌配子体, 进行反复冲洗, 必要时可用毛笔刷洗藻体表面,并在解剖镜下观察藻体表面是否足够干净, 无其他附生杂藻和泥沙等杂质。将脱脂棉进行酒精浸泡处理, 擦拭玻璃器皿以达到消毒目的。将灭菌的载玻片置于玻璃器皿底部,添加灭菌的海水。将清洗过的雌配子体及四分孢子体迅速转移至不同的器皿中, 并通入氧气。将藻体置于温度20℃, 光照强度80 μmol/(m2·s), 光周期(Light∶Dark)12L∶12D的条件下进行孢子的放散。1d 后,检查载玻片上孢子的释放量并将合格的载玻片转移至培养液中, 置于光照培养箱(LRH-250-GB)中培养。采用Olympus BX53荧光显微镜定时观察孢子萌发情况, 用目镜测微尺测量早期发育过程中各时期孢子直径大小并记录, 对原生质体的移动及萌发管的形成过程进行准确描述。每2天更换1次培养液。

1.3 基因序列分析

使用植物基因组DNA提取试剂盒提取藻体DNA后, 对rbcL和COⅠ基因进行PCR体外扩增、样品纯化并进行测序。引物组合为F57—R753、F654—R1381和F1—R1。详细的实验步骤及引物设计的方法参照Yang等[17]和Wang等[7]的实验。

从GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBank)网站获取了产自中国、韩国和日本的蜈蚣藻属的亚洲蜈蚣藻、中国产的蜈蚣藻属的齿状蜈蚣藻G. serra、台湾蜈蚣藻G. taiwanese和东方蜈蚣藻G. orientalis等12个种[6—11,18—23]及海膜属Halymenia的H. floresia和海柏属Polyopes的P. constrictus[24]2个外群种的rbcL基因序列与本研究中得到的8个聚果蜈蚣藻的rbcL基因序列, 获取了蜈蚣藻属11个种[22]及2个外群种海膜属的H. pseudofloresi和海柏属P. affinis[22]的COⅠ基因序列与本研究中得到的8个聚果蜈蚣藻的COⅠ基因序列进行分析比对。用软件ClustalX进行校正和比对[25], 用MEGA6.0软件分析碱基差异度并构建NJ、MP和ML系统发育树 , Bootstrap重复1000次[26]。

2 结果

2.1 聚果蜈蚣藻的外部形态

雌配子体藻体直立(图 1A), 高为5—15 cm, 主枝宽为1.5—2 mm; 单生或丛生; 呈紫红色; 质地为软骨质, 较黏滑; 1—2回羽状分枝; 对生、互生或偏生, 具有长短不一的小羽枝, 呈扁平或棍棒状, 基部缢缩, 常密集生长在2回羽状分枝的中部(图 1B); 囊果近球形, 常聚集在一起呈瘤状, 稍突出于藻体表面(图 1B和1C)。聚果蜈蚣藻的雄配子体未见。

图1 聚果蜈蚣藻雌配子体的外部形态及表面观Fig. 1 The morphological appearance and surface observation of G. sorocarpus

2.2 聚果蜈蚣藻的内部结构

营养结构: 聚果蜈蚣藻横切面厚度为510—680 μm,两端具有7—10层细胞为皮层, 皮层分为内、外皮层, 总厚度为60—70 μm, 外皮层4—6层, 细胞略小,多呈圆形; 内皮层3—4层, 细胞略大, 形状不规则,以多角形和星形较为常见。中央丝状区域为髓部,髓部内髓丝错综交织, 髓丝长为15—75 μm, 宽为2—3 μm, 皮层和髓部界限明显(图 2A和2B)。

生殖结构: 果胞枝生殖枝丛源于内皮层细胞,符合Grateloupia(6cpb-5auxb)型,包含1个主枝及2或3个不育侧枝, 均由1个支持细胞承载。果孢枝包含2个细胞, 即壶形果胞和下位细胞, 壶形果胞末端连接一条受精丝指向藻体表面, 受精丝位于藻体外侧, 呈弯曲或伸直状。果胞周围包括基细胞、下位细胞、亚下位细胞和圆形细胞, 这些细胞均带有一条不育侧枝弯向藻体表面, 形成瓶状体(图 2C)。

辅助细胞成熟时, 略大于周围其他细胞, 呈圆球形, 存在于辅助细胞生殖枝丛的底部。在成熟的辅助细胞周围可以观察到5个细胞, 各带有一条侧枝, 每条侧枝由10—12个细胞组成。辅助细胞及其周围细胞共同形成瓶状体(图 2D)。

果孢与精子完成受精作用后, 会与下位细胞、基细胞融合, 进而伸出联络丝与辅助细胞接触, 并形成融合复合体, 进而产生产孢丝指向藻体表面,其他未融合的瓶状体细胞则横向分裂形成营养丝。产孢丝末端形成若干球形果孢子。营养丝与其周围的髓丝相互缠绕形成囊果皮, 包被着果孢子,为囊果。成熟囊果直径为170—230 μm, 孢子囊的顶端有囊孔, 果孢子待成熟后经囊果孔逸出 (图 2E和2F)。

图2 聚果蜈蚣藻雌配子体的内部结构Fig. 2 The internal structure of gametophyte of G. sorocarpus

四分孢子体的藻体大小与雌配子体相似(图 3A),四分孢子囊突出于藻体表面,散生于藻体中上部(图 3B),待藻体趋于成熟时,部分内皮层细胞分化形成较大的孢子囊母细胞(图 3C), 孢子囊母细胞经减数分裂, 先形成二分孢子(图 3D), 最终形成四分孢子, 成熟后呈十字形分裂, 长为40—60 μm, 宽为20—40 μm(图 3E)。

图3 聚果蜈蚣藻四分孢子体的形态结构Fig. 3 The morphological structure of tetrasporophyte of G. sorocarpus

2.3 聚果蜈蚣藻的早期发育

聚果蜈蚣藻的囊果突出于藻体表面(图 4A), 囊果发育成熟后放散出紫红色的果孢子至载玻片上,果孢子球形, 直径20 μm左右(图 4B)。在24h后, 果孢子一端形成萌发管(图 4C), 并逐渐伸长, 原生质体逐渐向萌发管一端移动, 在原来的位置形成空泡,空泡内含有透明胶状物质(图 4D)。当萌发管不再继续伸长时, 果孢子及胶状物质间形成透明的隔膜,随后果孢子开始分裂(图 4E和4F), 随着细胞数目逐渐增多, 另一端的透明胶状物质逐渐变小甚至消失,当空泡及其内的胶状物质消失时即到达细胞团阶段(图 4G)。当细胞团在水平方向上分化出基细胞及在垂直方向上分化出顶细胞时则到达盘状体阶段(图 4H)。相邻的几个盘状体会相互靠近发生融合, 形成一个较大的盘状体, 即盘状体融合现象(图 4I和4J)。盘状体逐渐发育形成直立枝(图 4K), 直立枝继续生长发育形成聚果蜈蚣藻幼苗(图 4L), 四分孢子与果孢子形态大小相似,发育过程无明显差异。

图4 聚果蜈蚣藻的早期发育过程Fig. 4 The early development of G. sorocarpus

2.4 rbcL基因序列分析

本研究共获得了8条rbcL基因序列, 基因序列长度均为1259 bp, 对比矫正后的序列长度为1184 bp。

rbcL基因序列比对(MAGE6.0)结果显示, 本研究8个样本的rbcL基因序列无碱基差异, 与产自中国的亚洲蜈蚣藻无差异, 与产自日本和韩国的亚洲蜈蚣藻的碱基差异分别为3 bp(0.248%)和2 bp(0.124%), 且本研究的8个样本与亚洲蜈蚣藻在系统发育树中位于独立的进化支(图 5); 与蜈蚣藻属内其他11个种的碱基差异为17(1.505%)—98 bp(8.289%);与外群种P. constrictus和H. floresia的碱基差异分别为155 bp(13.100%)和154 bp(13.009%)。

图5 基于rbcL基因序列所构建的系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree based on partial rbcL sequences data

2.5 COⅠ基因序列分析

本研究共获得了8条COⅠ基因序列, 序列长度为641 bp, 对比矫正后的序列共20条, 序列矩阵长度为616 bp。

COⅠ基因序列比对(MAGE6.0)结果显示, 本研究的8个样本的COⅠ基因序列无差异, 与产自韩国和日本的亚洲蜈蚣藻无碱基差异, 它们在系统发育树中位于独立的进化支(图 6), 与蜈蚣藻属内其余9个种的碱基差异为18(2.94%)—80 bp(13.04%); 与作为外群种的P. affinis和H. pseudofloresii的碱基差异分别为107 bp(17.51%)和83 bp(13.59%)。

图6 基于COⅠ序列所构建的ML系统发育树Fig. 6 The Maximum Likelihood (ML) tree based on COⅠ sequences

3 讨论

本研究对聚果蜈蚣藻和亚洲蜈蚣藻的形态等特征进行观察比较, 发现二者藻体颜色、分枝类型十分相似(图 7A; 表 2)。两者仅在形态学上具有较小的差异: 聚果蜈蚣藻具有1—2回羽状分枝, 小枝短一般生长在2回羽枝中部, 雌配子体囊果近球形,常聚集在一起呈瘤状; 亚洲蜈蚣藻具有1—3回羽状分枝, 囊果随机散落分布在除固着器以外的整个藻体。蜈蚣藻属海藻根据生殖结构中助细胞生殖枝丛的不同可分3种类型。其中亚洲蜈蚣藻的生殖结构为(6cpb-5auxb)型, 果胞与下位细胞融合, 辅助细胞没有融合现象[5]。研究结果显示聚果蜈蚣藻的生殖结构与亚洲蜈蚣藻完全一致。

表2 聚果蜈蚣藻和亚洲蜈蚣藻形态学特征的比较Tab. 2 Morphological characteristics contrast between G. sorocarpus and G. asiatica

图7 亚洲蜈蚣藻与聚果蜈蚣藻的外部形态Fig. 7 The external morphological observation of G. sorocarpus and G. asiatica

研究发现, 聚果蜈蚣藻的孢子在萌发时会先形成萌发管并逐渐伸长, 随后细胞才会进行分裂, 进入盘状体时期, 发育类型为“间接盘状体”型, 与亚洲蜈蚣藻的孢子发育类型一致[27]。判断聚果蜈蚣藻与亚洲蜈蚣藻在形态学和早期发育及生活史水平上为同一种。

利用rbcL基因对进行了形态研究的聚果蜈蚣藻进行分子系统分析构建系统发育树, 结果显示本研究的8个聚果蜈蚣藻与产自中国辽宁大连、山东青岛的亚洲蜈蚣藻无碱基差异并形成独立的进化支，与产自韩国和日本的亚洲蜈蚣藻碱基差异为2 bp(0.124%)和3 bp(0.248%)。李芳等[16]提出蜈蚣藻属海藻的rbcL基因序列碱基差异在0.00—2.00%，均属于种内差异。基于COⅠ基因构建的系统树显示本研究的8个聚果蜈蚣藻与产自韩国和日本的亚洲蜈蚣藻无碱基差异并形成独立的进化支。因此认为聚果蜈蚣藻与产自韩国和日本的亚洲蜈蚣藻的碱基差异为种内差异。从分子水平上也显示聚果蜈蚣藻与亚洲蜈蚣藻为同一种。

亚洲蜈蚣藻在6—7月达成熟期, 在6—9月达生长盛期。达成熟期的雌配子体藻体表面具有囊果,因此采集日期的不同, 海藻处于不同的生长期, 有无囊果、囊果的大小及囊果是否聚集都会产生些许差异。由此可见, 海藻采集的地理位置不同和采集地的海水温度、盐度等生态环境的不同, 可导致同种海藻在外部形态上略微有些许差别。因此, 在传统的分类学中只根据某一标本的形态或某一时期标本的形态草率的建立一个新种是没有说服力的, 还需要利用分子分析的手段, 对进行了形态研究的每个种进行分子系统分析, 进一步确定属内海藻种间的系统关系及种内的遗传多样性, 来进一步验证经典分类的合理性, 运用分子辅助的形态分类学方法, 得到的结果才具有准确性。

通过分子辅助的形态分类学的方法对聚果蜈蚣藻进行研究, 确定其与亚洲蜈蚣藻为同一种, 根据优先法则, 将其作为亚洲蜈蚣藻的同物异名。