外源脱落酸对湿地植物美人蕉抗寒性的影响

陈金梅 褚一凡 谭启洋 刘 伟 杨玲丽 黄 涛 吴振斌 贺 锋

(1. 中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

人工湿地是人工建造的, 通过基质、植物和微生物的物理、化学、生物三重协同作用来净化污水的一种技术[1]。植物作为人工湿地重要组成部分之一, 不仅能摄取利用污水中营养物、吸收富集有毒有害物质, 还具有传输氧气、强化根际微生物、增强和维持介质的水利传输等作用。然而植物在人工湿地污水净化过程中的作用与其生长状况密切相关, 在气温低下的冬天, 植物进入休眠期甚至枯萎死亡, 不能在湿地系统中充分发挥其功能, 从而导致人工湿地系统在冬季净化效果下降。

目前现有的提高湿地植物的抗寒性方法主要有天然植物的抗寒性筛选[2,3]、诱变育种[4,5]和化学诱导[6]。本研究采用脱落酸处理湿地植物, 以期提升其抗寒性能。脱落酸(Abscisic acid, ABA) 作为植物五大激素之一, 是一种存在于植物体内的具有倍半萜结构的内源激素。有研究表明[7], ABA 作为重要的逆境信号分子, 可诱导抗寒基因发挥作用,即, 当植物遭受低温胁迫时, 植物体内 ABA 会迅速累积, 启动或诱导植物自身抗寒基因的表达, 参与低温胁迫信号传导途径, 从而使植物更快适应寒冷。ABA参与的抗寒过程一般分为3种: 一种是ABA依赖途径, 主要受转录因子和ABRE的调控[8,9],如PYR/PYL/RCARs(受体)、PP2C(负调控)和SnRK2s(正调控); 另外逆境诱导基因 RD28 和RD29 等也受ABA调控; 第二种是非ABA依赖途经,然而ABA的信号传导还是会影响基因的表达, 如lti78; 第三种是ABA与低温协同作用下才进行表达的基因, 例如cor47基因在经外源ABA处理后, 表达量有所升高[10,11]。由于研究ABA的相关生理过程可反映植物的抗逆机理, 揭示其应答基因及表达蛋白, 可定向增强作物对环境的适应力, 故被广泛应用于园艺和农业生产的抗寒性[12,13]、抗旱性[14,15]、盐胁迫[14]及沉水植物的金属胁迫[16,17]中。综上所述, 适宜浓度下的外源脱落酸预处理可增强植物抗逆生物效应, 但其在湿地植物领域的研究还未见报道。因此, 本研究拟将外源脱落酸应用于湿地植物美人蕉上探究其在低温状态下的生理响应。

美人蕉(Canna indicaL.)属多年生热带和亚热带植物, 喜温, 抗寒能力差, 生物量大, 适应力强, 根系发达, 被广泛应用于长江中下游的人工湿地系统中。时至今日, 已有学者对提高湿地植物的抗寒性进行大量探索, 但尚未探究外源脱落酸对湿地植物美人蕉耐寒性的影响。故本研究将采用不同浓度ABA处理美人蕉幼苗的叶片, 通过测定其抗寒指标的变化, 确定最适宜的脱落酸施用浓度, 再将其应用于人工湿地小试系统中, 探究适宜浓度的外源ABA对美人蕉植物本身抗寒能力的影响及其对自然冬季条件下人工湿地水质的反馈效果, 为突破湿地系统低温运行瓶颈提供新思路。

1 材料与方法

1.1 植物处理与方法

红花美人蕉幼苗来自于中国科学院水生生物研究所官桥研究基地, 取长势相近的美人蕉幼苗移植于塑料盆中, 幼苗高度为30—50 cm, 从基地移栽后在恒温室进行14d的缓苗期, 待长势稳定后, 放入低温光照培养箱中, 每组设置3个平行, 均重复实验3次。

试验设 6 个处理组, 为 0、5、10、15、20和25 mg/L ABA, 对照组(CK)为0 mg/L ABA美人蕉幼苗组。为模拟自然降温及日夜温差等因素, 本实验采取阶段性降温培养, 低温光照培养各阶段的温度梯度设置为昼/夜20℃/18℃、 15℃/13℃、10℃/8℃、 5℃/3℃和0℃/0℃, 光照参数为2300 lx, 8h。每个温度持续3d, 3d后自动降至下一梯度, 且在温度梯度切换时喷施一次相应浓度ABA至叶面完全浸湿, 于0℃时采集植株顶部从上往下第 2 至第 3位叶, 液氮冷冻保存于-80℃冰箱中, 留存并测定其相关生理生化指标。

1.2 植物生理生化指标测定

各项生理生化指标的测定参照李合生等[18—20],相对电导率采用电导法, 丙二醛测定采用硫代巴比妥酸法, 脯氨酸采用茚三酮显色法, 总可溶性糖采用蒽酮-硫酸比色法, 可溶性蛋白质采用考马斯亮蓝G-250法, SOD测定采用氮蓝四唑法, CAT测定采用过氧化氢比色法, POD采用愈创木酚法, 叶绿素测定采用乙醇法。

1.3 实验装置与方法

本研究采用垂直流人工湿地, 装置为内径200 mm、管高870 mm的PVC管, 装置内填充基质依次为100 mm高的粒径为5—8 mm粗砾石、300 mm高的粒径为2—4 mm细砾和200 mm高的粒径为0.5—1 mm石英砂(图 1)。装置正式运行时间为2019年12月至2020年1月, 采取自然降温模式, 装置设3个平行, 组别分别为无植物组(A组)、植物对照组(B组)和ABA喷施处理组(C组), 植物对照组和ABA喷施处理组各种植一株红花美人蕉, 种植深度10 cm。进水采用自配水, 配方如下: 蛋白胨80 g/m3、牛肉膏55 g/m3、葡萄糖100 g/m3、NaCl 3.5 g/m3、NH4Cl 28.5 g/m3、CaCl22 g/m3、MgSO41 g/m3和K2HPO419 g/m3。主要指标含量为CODcr (211.6±37.6) mg/L、TN (28.07±1.83) mg/L和TP (2.62±0.25) mg/L。

图1 试验装置图Fig. 1 Illustration of test installation

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0单因素方差分析对植物生理生化指标进行统计分析, 采用SPSS 17.0单因素方差分析对人工湿地各处理组和对照组的去除率进行统计分析, 各分析的显著性水平为P＜0.05, 并用Origin8进行绘图。

2 结果

2.1 0℃时各处理组生理指标含量变化的情况

细胞膜系统丙二醛(MDA)、相对电导率含量的变化由图 2可以看出, MDA各组之间均有显著性差异(P＜0.05), 其中15 mg/L脱落酸处理的美人蕉幼苗的MDA相比对照组降低了50.24%。此外, 在0℃时(图 3), 相对电导率各处理组与对照组之间均有显著性差异(P＜0.05), 但各处理组之间无显著性差异。

图2 0℃时不同浓度ABA对美人蕉叶片丙二醛的影响Fig. 2 Effects of different concentrations of ABA on malondialdehyde in Canna indica L. at 0℃

图3 0℃时不同浓度ABA对美人蕉叶片相对电导率的影响Fig. 3 Effects of different concentrations of ABA on relative conductivity in Canna indica L. at 0℃

在低温条件下, 相比于对照组, 15和20 mg/L的ABA处理组显著地增加脯氨酸在美人蕉幼苗叶片中的含量(P＜0.05), 相较于对照组增加到2.113倍(图 4), 15 mg/L的ABA处理组显著地增加蛋白质在美人蕉幼苗叶片中的含量, 且相较于对照组增加到2.01倍(图 5)。此外, 10 mg/L的ABA处理组显著地增加可溶性糖在美人蕉幼苗叶片中的含量, 相比于对照组增加到3.095倍(图 6)。

图4 0℃时不同浓度ABA对美人蕉叶片脯氨酸的影响Fig. 4 Effects of different concentrations of ABA on proline content in Canna indica L. at 0℃

图5 0℃时不同浓度ABA对美人蕉叶片蛋白质的影响Fig. 5 Effects of different concentrations of ABA on soluble protein content in Canna indica L. at 0℃

图6 0℃时不同浓度ABA对美人蕉叶片总可溶性糖的影响Fig. 6 Effects of different concentrations of ABA on total soluble sugar content in Canna indica L. at 0℃

抗氧化酶活性的变化由图 7可以看出, 0℃时经ABA处理的美人蕉幼苗与对照组相比均有显著性提高, 且10 mg/L处理组尤为显著(P＜0.05)。POD酶规律性不强, 只有在25 mg/L处理组下才与对照组有显著性差异(图 8)。CAT酶也可反映植物的抗逆性, 但在本实验中与对照组无显著性差异(图 9)。

图7 0℃时不同浓度ABA对美人蕉叶片SOD的影响Fig. 7 Effects of different concentrations of ABA on activities of SOD in Canna indica L. at 0℃

图8 0℃时不同浓度ABA对美人蕉叶片POD的影响Fig. 8 Effects of different concentrations of ABA on activities of POD in Canna indica L. at 0℃

图9 0℃时不同浓度ABA对美人蕉叶片CAT的影响Fig. 9 Effects of different concentrations of ABA on activities of CAT in Canna indica L. at 0℃

叶绿素含量变化由图 10可以看出, 10、15、20和25 mg/L 的ABA处理组相比对照组均有显著性提高(P＜0.05), 其中经15 mg/L ABA处理组与对照组相比, 可将植物叶片中的叶绿素提高1.8倍。

图10 0℃时不同浓度ABA对美人蕉叶绿素的影响Fig. 10 Effects of different concentrations of ABA on chlorophyll in Canna indica L. at 0℃

2.2 人工湿地系统冬季运行效果

表1所示为人工湿地运行在冬季运行期间的采样时间及当日的最低最高温度统计结果, 运行期间的COD、 TP和TN去除率测定结果如图 11—13所示。

表1 冬季应用试验期间温度实测结果Tab. 1 Illustration of temperature measurement during winter

图11 冬季COD去除率趋势图Fig. 11 Removal rates of COD in winter

由COD去除率结果可知, A组(无植物组)COD去除率为58.73%, B组(植物对照组)去除率为70.27%, C组(ABA喷施组)去除率79.49%, 三组间COD去除率有显著性差异(P＜0.05)。对TP去除率分析可知, A组去除率为23.69%, B组去除率为35.34%, C组去除率30.98%, 有植物组显著高于无植物组(P＜0.05), 但植物对照组与ABA喷施组无显著性差异, 这可能与冬季植物未完全枯萎相关。由图 13可知, A组去除率为26.67%, B组去除率为32.68%, C组去除率41.16%, 在试验前期, 三组TN去除率没有显著性差异且处于较平稳状态, 到后期,植物长势较好的组TN的去除率显著高于无植物组。

图12 冬季TP去除率趋势图Fig. 12 Removal rates of TP in winter

图13 冬季TN去除率趋势图Fig. 13 Removal rates of TN in winter

3 讨论

3.1 各处理组抗寒性比较分析

在高等植物体内, 细胞膜系统最容易受到低温迫害。低温会影响膜的通透性, 从而使细胞膜受损, 根据文献调研, 相对电导率也与膜损伤程度呈正比[21—23]。在逆境胁迫下, 植物体内原有的自由基平衡被破坏, 多余的自由基会引发或加剧膜脂过氧化作用[24]。膜脂过氧化的主要产物之一丙二醛(MDA), 其积累会对植物细胞膜造成一定伤害, 因为它会和与蛋白质、核酸结合, 抑制相关蛋白质的合成, 甚至可以减弱纤维素分子间的桥键连接[19,20,24]。在对水稻[25]、油棕[26]和甘蔗[27]等的研究中发现, 在外源 ABA 处理下, 植物体内中的MDA 积累量和相对电导率均降低, 进而减轻低温对细胞膜的胁迫作用[28]。在本实验研究中也有相似结论, 0℃时外施脱落酸通过降低相对电导率及丙二醛含量减缓低温胁迫给膜结构带来的损伤, 维持膜正常生理功能,诱导抗寒基因表达, 从而增强植物抗冷性。究其原因, 推测是外源ABA 可提高水分由根系向叶片输送效率, 提高细胞膜透性, 从而使膜的稳定性增加以减少电解质的渗漏, 此外, ABA还可诱导有关基因表达进而提高植物对寒冷的抵抗能力[27,29]。由图 2可知, MDA浓度随ABA浓度呈现先增后降再升的趋势, 推测低浓度或高浓度的ABA预处理会加重寒害对植物叶片细胞膜的损伤, 据图 3可知, 相对电导率在所选浓度区间呈现相似的效果, 据文献[22, 23]可知, ABA对细胞膜有一定的保护作用, 但针对不同植物其对相对电导率的处理敏感度较低,效果一般, 而适宜浓度下更能缓解膜脂氧化程度,故需要多个生理生化指标来综合判断。

在低温胁迫下, 植物细胞通过积累一些渗透调节物质来缓解低温对植物本身造成的伤害[30—32]。其中, 参与相关过程的渗透调节物质有脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖, 一方面可保护蛋白质分子来缓解低温胁迫对细胞伤害, 另一方面启动植株体内的抗寒机制, 诱导合成相关蛋白质, 形成脱落酸等物质[28,33—35]。以往的研究结果表明, 施加外源ABA 可通过提高植物体中可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸等渗透调节物质的含量来增强植物的抗寒性, 并使其逐渐适应低温环境[33,36]。在本实验中, 在0℃时, ABA浓度与可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量整体均呈现低促高抑的趋势, 这说明在适宜浓度的ABA预处理下, 美人蕉幼苗体内通过调节渗透物质来平衡细胞内外物质, 此外细胞膜的稳定性也会大大增强, 进而提高美人蕉幼苗对低温的抵抗能力[21]。

低温会降低植物对 O2的利用能力, 打破植物体内的活性氧( Reactive Oxygen Species, ROS)平衡, 过量的ROS会攻击细胞大分子, 引起一系列有害的生化反应, 造成蛋白质损伤、脂质过氧化、DNA 突变和酶失活等, 进而损伤植株[24,37—39]。在本研究中, SOD、POD和CAT未见明显的规律性,这一现象的产生可能与美人蕉响应低温胁迫的不同途径有关, 也可能是ABA预处理对该系统的效果不显著或者是美人蕉物种与其他物种间响应机制的差别, 尚需进一步研究, 但此结果与前人在茶叶叶片[36]、玉米幼苗[40]和橡胶树芽[41]等中的研究结论相符。

叶绿素是作物进行光合作用的主要物质, 是植物所有生命活动的基础。低温胁迫会使叶绿素合成受阻, 且低温胁迫时间越长, 叶绿素含量越少, 伴随着叶绿素含量的降低, 叶片光合作用也随之衰退[42]。研究表明, 造成叶绿素含量减少的原因有很多, 一部分学者[35,43—45]认为, 低温使原有叶绿素受到破坏是叶绿素含量减少的主要原因; 另一部分学者[46]则认为叶绿素含量的下降主要是因为低温限制了叶绿素的合成。而逮明辉等[47]认为在低温下叶片的叶绿素降解加剧, 合成能力降低, 才是导致叶绿素总含量下降的主要原因。本研究发现, 适宜浓度的脱落酸应用可以提高低温胁迫下美人蕉叶片中叶绿素含量, Wang 等[48]认为被植物色素A(phyA)和phyB感知到的远红光(FR)和红光(R)分别正向和负向调节番茄的耐寒性, 这种调节有关脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)等植物激素及ABA和JA相关基因相关, 而此种响应在水稻[49]和Bermudagrass[50]中也有发现。

3.2 人工湿地低温状态下净化效果比较分析

有研究认为, 人工湿地即使在冬季低温下仍对COD有较好的去除率[51]。本研究证明, 植物确实可显著提高湿地对COD的去除, 且植物在冬季长势越好, 存活时间越久, COD的去除效率就越高, 这与华昇等[52]研究结果相符。湿地植物在生长过程中的营养来源是污水中的无机氮[53], 已有研究表明, 不同湿地植物对 TN 的吸收量仅占人工湿地 TN 去除量的 0.6%—17.3%[54], 本实验也可看出在寒冷的冬季, 人工湿地的TN的去除率偏低, 植物的对N的同化吸收确实可以在一定程度上提高冬季湿地的运行效果。众多学者认为, TN的去除率因季节原因波动较大[55], 夏季TP的去除率比冬季高6.1%—34.0%[56]。而本实验结果表明, 植物耐寒性的提高对人工湿地中TN的去除率影响较小, 推测是因为植物对磷的去除起小部分作用, 主要还是靠基质的吸附和微生物的作用。

4 结论

在低温胁迫下, 一定浓度的外源脱落酸预处理使美人蕉叶片中的叶绿素、脯氨酸、可溶性糖和蛋白质含量升高, 丙二醛含量和相对电导率降低,但SOD、POD和CAT未见明显的规律性, 综合各项生理生化指标及表观现象, 适宜的ABA处理浓度为15 mg/L。用15 mg/L的脱落酸对美人蕉幼苗进行预处理时可显著提高人工湿地冬季TN、COD和TP去除率。