鸡胚无壳孵化研究初报

杜金娥，董志岷，王 贵，刘 畅

（河套学院农学系，内蒙古 巴彦淖尔 015000）

无壳孵化是一项新颖且备受关注的人工孵化技术，是人工孵化领域的又一次突破。无壳孵化对于推动孵化科技及生命科学的进一步发展具有里程碑式的意义。鸡胚发育过程清楚，尤其在鸡胚发育早期绒毛尿囊膜阶段，因其血管丰富，是天然的免疫缺陷宿主，常作为病理学、药理学和肿瘤学等研究领域的理想实验模型。有资料显示，研究人员采取代用蛋壳孵化、窄窗口蛋壳整胚胎培养及人造容器培养的孵化率均较低，且使用代用蛋壳的培养方法有很多弊端，如不同批次代用蛋壳有差异，无法循环利用，胚胎操作过程中可操作性低等［1-2］。为了建立一种无壳孵化成功率较高的简单培育方法，笔者使用方便的透明玻璃杯而不是代用蛋壳作为人工培养容器，在其中补充钙和水，通入氧气等，通过孵化期间剖视对照组种蛋的鸡胚生长发育情况，并与试验组同日龄无壳鸡胚的生长发育情况作对比，及时调整试验组孵化条件，以提高鸡胚的无壳孵化率。

1 材料与方法

1.1 材料 种蛋：本试验所用种蛋均为同一蛋鸡舍所产的5 d 内新鲜种蛋，品种为红波罗红羽肉鸡，又名红宝，蛋重在55～60 g之间。

其他试剂及材料：青霉素钾（400万单位∕支），硫酸链霉素（100 万单位∕支），两性霉素B、乳酸钙，新洁尔灭；聚甲基戊烯薄膜，透明玻璃杯，暖立方孵化器。

1.2 试验设计 本试验分对照组和试验组两组，两组均选用同一品种、重量接近、新鲜度一致的种蛋各20 枚，所用孵化器型号相同，孵化条件一致。对照组种蛋经过消毒后直接放入孵化器孵化，试验组种蛋经过消毒后先预孵化55 h再去壳放入人工培养容器中于孵化器内继续孵化。

1.3 方法

1.3.1 无壳孵化时小环境的准备 将透明杯洗净消毒，使用时用纯化水冲洗，在透明杯下缘2 cm 的高度打孔，直径为1.5～2 cm，孵化前期（第1～18 d）在洞口堵上棉絮作为过滤器，用一根直径2 mm 的塑料管插入棉絮和洞之间的空隙提供氧气，同时用于孵化至18 d以后注入氧气使用，代替19 d鸡胚启用肺呼吸所需大量氧气。然后在杯内注入青霉素钾＋硫酸链霉素＋两性霉素B抑菌水备用（如图1）。

图1 无壳鸡胚人造培养容器示意图

1.3.2 聚甲基戊烯薄膜的准备 用5%新洁尔灭消毒且晾干的种蛋在聚甲基戊烯薄膜上撑出蛋形（如图2），并固定于注入抑菌水的透明杯内，用橡皮筋固定杯口，在有蛋形的聚甲基戊烯薄膜内加入乳酸钙和纯化水。

图2 处理聚甲基戊烯薄膜示意图

1.3.3 种蛋去壳后的孵化 在预孵化了50～55 h的种蛋钝端划线，用消毒过的剪刀尖扎眼儿，沿划线剪2 cm 长的孔隙，轻轻将蛋液打入已加入乳酸钙和纯化水的聚甲基戊烯薄膜内。在聚甲基戊烯薄膜上方距离蛋液0.5 cm 处打8～10 个直径约1 mm 的通风孔，代替蛋壳表面的气孔，盖上透明杯杯盖（如图3），放入孵化器开始孵化（如图4）。

图3 预孵化55 h的种蛋去壳效果图

图4 无壳鸡胚放入孵化器入孵

1.3.4 鸡胚死亡判定方法 鸡胚心跳消失，血管颜色变暗，界限模糊，可判定鸡胚死亡。

2 结果及分析

2.1 鸡胚存活率情况 根据统计，对照组种蛋在第7～16 d 鸡胚死亡率为5%，第17～18 d 死亡率又增加5个百分点；试验组鸡胚有两个死亡高峰：第一个是在第7～10 d，死亡率为30%，第二个是集中在第16～18 d，死亡率在第一个死亡高峰的基础上又增加50～70个百分点，直至第18 d时鸡胚全部停止发育，存活数为0。

表1 不同胚龄的鸡胚存活率

2.2 第3～7 d 出现死亡的原因分析 孵化至第3～7 d，对照组死亡率为5%，试验组死亡率为0。此期正是胚胎生长迅速、形态变化显著时期，各种胎膜相继形成而功能尚未完善，对环境变化敏感，易导致胚胎夭折，是孵化过程中的第一个死亡高峰期。另外，种蛋贮存不当会降低胚胎活力，维生素A缺乏也会有重大影响。

2.3 第16～18 d 出现死亡的原因分析 第16～18 d，对照组死亡率为5%～10%，试验组死亡率为75%～100%。此期是鸡胚呼吸方式由尿囊呼吸转向肺呼吸的关键时期，胚胎生理变化剧烈，需氧量剧增，自身产热猛增，通风换气不足而导致胚胎死亡，形成孵化过程中的第二个死亡高峰期。试验组鸡胚在此期没有顺利完成由尿囊呼吸向肺呼吸的转变，吸入氧气不足，故出现大量死亡。

3 提高无壳孵化率的因素分析

3.1 通风换气 通风换气是无壳孵化较难掌握的环节，氧气、二氧化碳含量对孵化率都有明显的影响，如氧气含量在21%时孵化率最高，氧气含量每升高1%，孵化率下降1%，氧气含量每下降1%，孵化率下降5%。二氧化碳含量控制在0.5%以下对孵化率没有明显影响。因此，与蛋液直接接触的聚甲基戊烯薄膜上气孔直径不能过大，数量不能过多，否则氧气通入量过多，蛋液的蒸发速度高于鸡胚对蛋液的吸收速度，蛋液变干而易导致鸡胚死亡。

3.2 钙的添加 对于鸡胚来讲，蛋壳具有保护鸡胚防止外界细菌侵入蛋内的作用，另外，蛋壳的主要成分为碳酸钙，可以为鸡胚发育提供所需的钙质。孵化至第11 d，鸡胚开始从蛋壳中吸收钙，第19 d 达到最高峰，因此鸡胚中80%的钙来源于蛋壳。为防止鸡胚在发育过程中因缺钙受到影响，或避免孵出的小鸡出现畸形（如爪部弯曲，不能站立等），甚至出现存活率低下等问题，要在入孵前加入一定量的乳酸钙来代替蛋壳中的钙。

3.3 无菌操作 无壳孵化过程中由于鸡胚脱离蛋壳，失去了蛋壳的保护，外界微生物极易侵入污染早期胚胎，因此去壳的过程需在超净工作台上进行。

3.4 转蛋要求 转蛋的目的是改变胚胎方位，防止胚胎粘连，使胚胎各部分均匀受热，促进羊膜运动。本试验使用的瑞科自动孵化器设定了转蛋次数，孵化第1～18 d，每90 min转蛋一次，转蛋角度应与垂直线呈45°角。由于试验组种蛋已去掉蛋壳，故转蛋需人工操作，即在玻璃杯下方支一物体，使玻璃杯倾斜，且达到45°转蛋角度，每隔90 min 反向转至对侧的同一位置。因鸡胚失去蛋壳保护，故手动转蛋时动作要轻，以防尿囊破裂造成鸡胚发育中断而死亡。

Assheton［3］、Perry［4］、Naito［5］、Ono［6］等人曾用不同人工培养容器培养鸡胚，但是孵化率均较低。笔者使用透明聚甲基戊烯薄膜来孵化，不仅能从任何角度肉眼观察胚胎的生长发育阶段及其形态变化，而且只要拿走塑料盖揭开薄膜就可以进行胚胎操作。目前，进一步提高无壳鸡胚的孵化率是未来研究的重要方向，如果能获得稳定的孵化率，将对胚胎操作具有很大的帮助，不但可用于再生医学的基础研究，也可以用于组织培养，鸟类胚胎干细胞的研究以及作为生物反应器鸡蛋的批量生产。