自拟益气养血方对气血两虚型功能性便秘大鼠肠道菌群影响的实验研究

于大远 李维康 李雪 刘立阳 刘仍海

功能性便秘(functional constipation, FC)属于慢性便秘的一种，指排除肠管器质性病因，没有结构异常或代谢障碍，无药物等继发性因素所致的便秘。研究表明，很多常年便秘的患者，往往会存在肠道菌群的失调。当今现代医学治疗FC常采用泻剂、促动力药物、促分泌剂、灌肠剂及栓剂等药物治疗，或生物反馈治疗等物理因子治疗，或手术治疗等方法，虽短期疗效较好，但是远期疗效欠佳，且易致药物依赖、结肠黑变病、肠道菌群失衡等不良反应[1]。中医治疗FC具有疗效明确，副作用小等优点，近些年研究发现，通过中药干预可改善肠道菌群。中医认为便秘有实秘和虚秘之分。因为针对气血两虚型FC，本课题组采用自拟益气养血方，疗效较好。为观察其对肠道菌群的影响，本研究通过大黄灌胃联合尾静脉放血建立气血两虚型FC大鼠模型，观察自拟益气养血方对大鼠的一般情况、粪便重量，以及对肠道菌群的多样性(α多样性、β多样性)和各菌种丰度的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究使用SD清洁级雄性大鼠50只，体质量为(200±20)g，8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限责任公司，动物许可证编号SCXK(京)2019-0028，饲养于SPF级动物室，恒定室温及湿度(22℃～25℃，50%～60%)，通风干燥，昼夜光照恒定12/12小时，不限饮食水。适应环境 1 周。

1.2 实验药物、试剂与仪器

中药自拟益气养血方颗粒，组方：人参15 g、黄芪20 g、生白术30 g、肉苁蓉15 g、当归10 g、生地黄15 g、白芍10 g、川芎10 g、杏仁9 g、柏子仁10 g、玄参10 g、麦冬10 g、郁李仁15 g、火麻仁15 g、桃仁10 g。核酸纯化试剂盒(货号：A63881，美国贝克霍特曼容克特有限公司)；高保真PCR试剂盒(货号：KK2631，美国KAPA)；PCR 扩增仪(货号：KK2631，赛默飞世尔科技有限公司)；荧光定量仪(赛默飞世尔科技有限公司)；LightCycler实时定量 PCR 仪(Roche Inc)；图像分析软件(美国Media Cybernetics)。

1.3 造模与分组

综合参考童卫东、许新晖、杜丽东[2-4]等人的造模方法，制备气血两虚型FC大鼠模型。随机抽取10只大鼠为空白组，每日定时给予空白组纯净水10 mL/kg。其余40只给予大黄溶液10 mL/kg，其中大黄的给药浓度需按一定规律每日200 mg/kg递增至终浓度为3600 mg/kg饲养3个月，具体给药情况为：首次灌服剂量为200 mg/(kg·d)，再按每日200 mg/kg递增至1000 mg/kg，超过半数大鼠出现腹泻，维持此剂量3天，70%～80%以上动物稀便消失，每日再按200 mg/kg递增至2200 mg/kg，半数以上动物出现腹泻，维持此剂量7天，70%～80%以上动物稀便消失，每日再按200 mg/kg递增至2800 mg/kg，半数以上动物出现腹泻，维持此剂量12天，70%～80%以上动物稀便消失，每日再按200 mg/kg递增至3200 mg/kg，半数以上动物出现腹泻，维持此剂量21天，至60%～70%以上动物稀便消失，每日再按200 mg/kg递增至3600 mg/kg，半数以上动物出现腹泻，维持此剂量35天,待70%～80%以上动物稀便消失后停止给药，一周后各组给予相应处理。

同时第10周起，每周大鼠尾静脉放血，每次1～1.5 mL，直到第12周造模结束[5]。造模期间，每日记录大鼠的饮食、饮水、活动情况，以及体质量、皮毛、反应性等，并称量两组大鼠24小时粪便湿重、干重来研究粪便情况。造模组大鼠24小时粪便重量和数量明显减少，且粪便干/湿比重明显增加，体质量减轻，耳、鼻、唇、尾苍白，精神萎靡，活动量、饮食减少、毛发干枯，可以判断造模成功。将造模成功的40 只大鼠，除8只大鼠处死取材外，其余32只随机分为模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组各8只。

1.4 干预方法

采用自拟益气养血方治疗，按照成人用药剂量的 150%、100%、50%对应设置益血气养血方高、中、低剂量组。按照人转换为大鼠剂量的转换系数(6.17)进行转换，计算大鼠灌胃剂量。经转换，低、中、高三组剂量灌胃剂量分别为7.56 g/天、9.53 g/天和11.51 g/天。 空白组和模型组仅正常饮食、饮水，无任何其它处理。共干预4周。在末次给药时进行取材。

1.5 取材方法

每只大鼠予10%的活性碳混悬液1～2 mL灌服，30分钟后经过异氟烷诱导麻醉后大鼠脱颈处死。大鼠处死后，取出大肠组织，于结肠中端、结肠末端、直肠分别取1粒粪便(若结肠内无粪便，则取直肠内粪便3粒)装入冻存管，并放入液氮中，l小时内移至-80°C冰箱保存[6]。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 一般情况 观察记录治疗前后大鼠进食量、饮水量、毛发光泽程度、体质量、精神状态、活动度等情况的改变。

1.6.2 粪便情况 观察治疗前后各组大鼠24小时粪便颗粒数，称量粪便湿重、干重来研究粪便情况。

1.6.3 肠道菌群情况 观察治疗后各组大鼠肠道菌群的多样性和各菌群的丰度。将得到的大鼠粪便颗粒通过PCR扩增，所得到的基因序列采用OTU聚类分析方法，即相似度高于97%的序列聚类为一个OTU。在此基础上进行α多样性分析、β多样性分析。α多样性是指某一特定区域或系统内的多样性，为反映丰富度、均匀度和多样性的综合指标。其中Chao1指数和ACE指数可反映群落丰富度，Shannon指数和Simpson辛普森指数可反映群落多样性。β多样性分析是对多个样本间物种多样性的比较，以评估微生物群落结构之间的相似性和差异性。β多样性分析包括样本层级聚类分析、样本距离热图、PCA分析、PCoA分析、 NMDS分析等多种分析方法。利用平台得到各组大鼠在门水平和属水平上的肠道菌群丰度。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

药物治疗前,与空白组相比,模型组大鼠进食较空白组减少，毛发稀疏，精神萎靡，排便减少，活动量减少，体质量降低，说明造模成功。治疗后,与模型组比较,采用自拟益气养血方治疗的各组大鼠精神、饮食等情况有所恢复，体质量高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。益气养血方不同剂量的各组，治疗后体重差异无统计学意义。结果如表1。

表1 各组大鼠治疗前后体质量比较

2.2 各组大鼠粪便情况

药物治疗前，造模组大鼠粪便重量(干重和湿重)都小于空白组大鼠，干/湿比较高，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，与模型组相比，采用益气养血方治疗的各组粪便干量和湿重增加更为显著(P<0.05)。与低剂量组相比，中剂量组和高剂量组粪便干量和湿重更高，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后，中剂量组和高剂量组粪便干重和湿重差异无统计学意义(P>0.05)。表明经过益气养血方治疗4周，大鼠体质量显著增加，粪便重量增加，干/湿比下降。结果如表2。

表2 各组大鼠治疗前后粪便重量比较

2.3 各组大鼠肠道菌群情况

2.3.1 Alpha 多样性 如表3、表4所示，与空白组比较，造模组sobs指数、chao指数、ace指数、shannon指数低于空白组, simpson指数高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。经过治疗后，低剂量组、中剂量组、高剂量组ace指数、sobs指数、chao指数、shannon指数均高于模型组，simpson指数低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。采用益气养血方治疗的3组，所有指数的差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 治疗前两组大鼠肠道菌群α多样性指数比较

表4 治疗后各组大鼠肠道菌群α多样性指数比较

2.3.2 Beta多样性 从PCA图可以看出，造模组与空白组所在的置信区间距离较远,说明造模前后肠道菌群差异较大。低剂量组、中剂量组和高剂量组所在的置信区间重合度较高，且与模型组所在的置信区间距离较远。说明采用自拟益气养血方不同剂量的治疗的菌群组间差异不明显，与模型组组间差异较大；中药不同剂量的三组中高剂量组治疗后肠道菌群与空白组组间差异最小。表明经益气养血方治疗4周后，肠道菌群的多样性较治疗前提升。见图1。

(A) (B) (C)

2.3.3 菌群组成比较 如图2所示，门水平上，造模后，拟杆菌门(bacteroidetes)、变形杆菌门(proteo bacteria)、放射菌门(act inob acteria )等菌门的丰度较空白组降低，厚壁菌门(firmicutes)、疣微菌门(verrucomicrobia)等菌门的丰度较空白组升高。药物治疗后，与模型组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组的厚壁菌门(firmicutes)、疣微菌门(verrucomicrobia)丰度较低，拟杆菌门(bacter oidetes)、变形杆菌门(proteobacteria)、放射菌门(actinobacteria )等菌门丰度较高(P<0.05)。中药不同剂量的三组，各菌门丰度的差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 门水平下各组物种Bar图

如图3所示，属水平上，造模后，Blautia菌属、粪球菌属(coprococcus)、梭菌属(clostridia)和瘤胃球菌属(ruminococcus)丰度升高，未分类的梭菌科(clostridia_unclassified)、双歧杆菌属(bifidobacterium)丰度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；乳杆菌属(lactobacillus)丰度升高，异杆菌(allobaculum)丰度降低,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，与模型组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组Blautia菌属、梭菌属(clostridia)、未分类的梭菌科(clostridia_unclassified)、粪球菌属(coprococcus)和瘤胃球菌属(ruminococcus)丰度较低，双歧杆菌属(bifidobacterium)丰度较高，差异有统计学意义(P<0.05)；乳杆菌属(lactobacillus)丰度较低，异杆菌(allobaculum)丰度较高，差异无统计学意义(P>0.05)。表明经过益气养血方治疗4周后，大鼠肠道菌群的构成有所改善，门水平上厚壁菌门、疣微菌门丰度降低，拟杆菌门、变形杆菌门、放射菌门等菌门丰度升高，差异有统计学意义(P<0.05)；属水平上，Blautia菌属、梭菌属、未分类的梭菌科、粪球菌属和瘤胃球菌属丰度降低，双歧杆菌属丰度升高，差异有统计学意义(P<0.05)，乳杆菌属和异杆菌属治疗前后丰度变化不明显(P>0.05)。具体数值见表5、表6。

图3 属水平下各组物种Bar图

表5 大鼠造模后肠道菌群重要菌属丰度比较

表6 各组大鼠干预后肠道菌群重要菌属丰度比较

3 讨论

正常人和动物肠道内寄居着大量的微生物，分属于不同的种群，发挥着各自不同的作用。正常情况下，各种肠道菌群之间保持着相互制约的关系, 以维持稳定的肠道微生态系统，一旦这种平衡关系被打破，某些条件下的致病菌占据优势，就会导致各种疾病的发生[5]。研究发现，患者肠道菌群的组成和数量与健康人群有显著差异，肠道微生态环境是FC发生和发展机制中的重要环节。如Khalif IL等[7]研究发现，成人便秘患者中肠道巴氏杆菌、乳酸菌、双歧杆菌双歧杆菌和乳酸杆菌的浓度显著降低，可致病的细菌和真菌增加。张旭、于阿莉等[8-9]研究发现便秘患者肠道菌群中的双歧杆菌含量明显降低，而巴氏杆菌、乳酸菌、肠杆菌含量显著升高。有研究表明，通过调节肠道菌群可以治疗便秘。冯现合[10]在乳果糖治疗的基础上联合双歧杆菌三联活菌胶囊治疗功能性便秘，可以调高有效率，调节胃肠道功能，且安全性更好。周凯旋等[11]研究证实复方嗜酸乳杆菌片对便秘具有治疗作用,并对肠道菌群具有调节作用。杜三军等[12]发现以FMT联合果乳糖治疗，治疗后,实验组Bristol粪便性状评分较对照组高,Wexner便秘评分(wexner continence grading scale)、便秘患者生活质量评价表(patient assessment of constipation symptoms and quality of life，PAC-QOL)评分较对照组低。

中医学认为，便秘的发病机理主要为大肠传导功能失司，大肠传导糟粕的功能离不开气的推动和血津液的濡养。若气虚推动无力，血少肠燥津亏，大便干结，则可以导致便秘，此为因虚致实之证。如北宋《太平圣惠方·卷第二十九·治虚劳大便难诸方》曰：“夫虚劳之人。脾肺损弱。谷食减少。气血阻隔。阴阳不和。胃气壅滞。上焦虚热。流注大肠。故令秘涩也。”明代张景岳《景岳全书·秘结》指出:“秘结证，凡属老人、虚人、阴脏人及产后、病后、多汗后，或小水过多，或亡血失血大吐大下之后，多有病为燥结者，盖此非气血之亏，即津液之耗。”清代李中梓《医宗必读·大便不通》说：“更有老年津液干枯，妇人产后亡血，及发汗利小便，病后血气未复，皆能秘结。” 气与血，一为阴，一为阳，一为体，一为用，二者相互依存,相互滋生,相互制约，相互为用。如《难经·本义》《医学真传·气血》等中医典籍所言，“气中有血,血中有气,气与血不可须臾相离,乃阴阳互根,自然之理也”。气能生血，血能化气，故气虚和血虚二者往往同时出现，相兼为患。因此治疗时当益气养血，润肠通便。自拟益气养血方由四物汤、增液汤、黄芪汤、五仁丸组合而来，方中人参主补五脏，补气之力较强，具有大补元气之功；黄芪补气升阳，益卫固表、脱毒生肌、利水消肿，二药相须配对，具有强大的补气助阳作用;且人参守而不走，黄芪走而不守，二者一走一守，阴阳兼顾，彻里彻外，通补无泻。白术具有益气健脾之功，大量生白术使用，可以起到健脾通便的作用，是治疗疗脾气虚便秘的要药。正如《本草通玄》所言：“补脾胃之药，更无出其右者，土旺则清气善升，而精微上逢；浊气善降，而糟粕下输，白术健脾益气，能升清降浊，而无温燥耗伤阴血之弊。”之所以炒白术可以用于治疗脾虚泄泻，而大量的生白术可以用于通便，是因为“白术之功在燥，而所以妙处在于多脂”(《神农本草经读》)。生地黄、玄参、麦冬三味药取增液汤之意，生地黄滋阴补肾、清热凉血，玄参滋阴清热、凉血解毒、滑肠，麦冬滋阴润肺，益胃生津，三药合用大补阴液，润滑肠道，增水行舟，促使糟粕下行，“增水行舟之计，故名增液，但非重用不为功”(吴鞠通《温病条辨》)。肉苁蓉补肾阳、益精血、润肠通便，可用于肾阳和肾精不足之便秘。白芍敛阴养血，破阴布阳，大量生用具有通便之功，《名医别录》谓之“主通顺血脉，缓中，散恶血，逐贼血，去水气，利膀胱、大小肠”，当归养血活血，润肠通便，为血家必用之药。川芎活血行气止痛，为血中气药。杏仁滋润肠燥，且能降肺气以利大肠传导；桃仁活血调经、润肠通便；柏子仁养心安神、润肠通便；郁李仁润肠通便、下气利水；火麻仁润肠通便，以上五味药物取五仁丸的中的“五仁”，集富含油脂的果仁于一方，可有效润滑肠道。经过该方治疗后，有益菌如双歧杆菌菌属丰度升高。双歧杆菌属于放线菌门，其生理作用远远超过其他菌种。其作用主要体现在：能够通过代谢产生有机酸和其他抗菌活性物质，竞争性抑制有害细菌和病原菌的增殖或感染；调节便秘患者血清中的胃肠调节肽水平[13]；促进乳酸的产生、降低肠道pH值，从而促进肠道运动，缓解便秘。研究发现，经治疗后丰度下降的菌属，如粪球菌属、瘤胃球菌属等可以导致便秘。

综上所述,益气养血方治疗功能性便秘不仅可改善大鼠的排便情况，还可以提高肠道菌群的多样性，提高有益菌的丰度，降低有害菌丰度，为中药治疗FC的作用机制等进一步的研究奠定基础。