DNA折纸在纳米生物医学中的应用

王建华，张 萍，夏青林，魏余辉，陈文勇，王 静，李鹏程，李 宾，周星飞

1宁波大学物理科学与技术学院，浙江 宁波 315211；2中国科学院上海应用物理研究所物理生物研究室，上海 201800；3中国科学院大学，北京 100049；4中国科学院上海高等研究院，基础交叉中心，上海 201210

大多数生物都是以DNA作为遗传物质，然而DNA作为一种纳米材料却是近几十年来的新尝试。1982年，Seeman教授提出将DNA分子视作一个基本单元，利用碱基互补配对原理将其组装成一些简单的具有特定几何形状的纳米结构［1-3］。2006年，Rothemund发展了一种新颖的DNA 自组装方法，即DNA 折纸技术（DNA origami）［4］。该技术是指长的单链DNA支架（通常是噬菌体M13），与数百条与之互补的短链DNA（通常20～60 bp）相互配对，通过编程设计折叠成具有一定形状、不同维度的纳米物体，如长方形、三角形、笑脸等［5-7］。同年，有学者利用这一技术“折”出了中国地图，这也是利用DNA折纸构建的第一个不对称的纳米图形［8］。早期的DNA折纸合成的结构比较简单，但经过科学家们的不懈努力，DNA折纸术在短短的十几年中得到了飞速发展，目前已经组装出许多二维、三维甚至带有曲面的复杂结构［9-12］。由于DNA折纸其内部具有很多单链DNA的交叉结构，其弹性模量约为单根DNA的数倍［13］，从而大大增加了DNA折纸内部结构的稳定性和韧性，为其在各个领域的应用奠定了坚实的基础。

鉴于DNA折纸具有精确的可寻址性以及结构稳定性等优势，使其在诸多领域有较大的应用前景，如生物材料制备、药物靶向递送以及疫苗研究等［14］。例如，利用预先设计的3D打印技术，在外界温度调控下实现DNA 纳米结构自发折叠，构建了复杂的三维立体结构。该技术有望应用于智能医疗植入［15］。在纳米医学领域，DNA纳米技术展现了巨大的潜能，DNA折纸术作为一种独特的DNA自组装技术，近年来获得了广泛关注，由于折纸具有结构精确可控、易于化学修饰和生物可降解等特点，其在生物分子检测、靶向给药和生物材料合成等方面具有广阔的应用前景。本文对DNA折纸在以上3个方面的应用做了简单的综述。

1 DNA 折纸用于生物传感

科学家一直在研究如何精准地控制DNA的纳米结构用于生物分子的检测。2009年，Andersen设计了一种可以打开释放药剂分子的正方形盒子，同时在盖子上安装了一个“锁”，起到传感器的作用，这个结构可以探测癌细胞等生物大分子，并确保药物分子能够精准释放［16］。近日，基于DNA折纸结构发展了一系列纳米结构作为原子力显微镜的力学成像探针，在单分子水平实现了对DNA分子的特异性标记和单核苷酸变异性的直读检测［17］。相较于基于荧光成像的直读方法，这种新技术将检测分辨率提升了一个数量级，可达到远超光学衍射极限的10 nm分辨。这种基于DNA纳米折纸结构的探针为原子力显微镜图像获取提供了精确的标尺，为遗传分析提供了新的工具。这种单分子水平的检测分析通量高，可靠性好，有望用于与疾病相关基因的鉴定。

DNA折纸本身还可以用来检测紫外线的强度。紫外线长期以来被认为会损害核酸，最近学者开发了一个DNA折纸辐射计［18］。不同于线性DNA链在紫外线照射下往往会降解成小段，DNA折纸的结构复杂性和链间连接性显著改变了紫外线诱导的DNA损伤的途径。对于DNA折纸无论其形状和大小，都可以观察到其膨胀并最终分解的一般途径。因此通过监测DNA折纸纳米结构的形态演变来测量紫外线照射强度，这种依赖于结构的变形可以转化为基于DNA折纸的辐射计，用于测量环境中的紫外线剂量。

值得指出的是DNA折纸最近被用来精准测量抗原和抗体的相互作用。譬如瑞典卡洛林斯卡研究所的科学家利用DNA折纸测量了密集的抗原之间最精确的距离，以获得与免疫系统中抗体的最强结合［19-20］。目前，许多新的疫苗使用了一种叫做“粒子展示”的概念，这意味着抗原以粒子的形式被引入体内，并以粒子的形式呈现给免疫系统，这些粒子表面有许多密集的抗原。在某些情况下，抗原的颗粒作为疫苗比单纯提供游离抗原更有效。抗体有一个Y形结构，Y形结构类似一个人的“手臂”，每个“手臂”都能与抗原结合。这样，每个抗体分子通常可以结合两个抗原分子。研究发现抗原彼此之间的紧密程度和距离不会显著影响抗体同时结合两个分子的能力［21］。为了进一步研究抗原和抗体的结合效果，Zhang等［22］利用三角形的DNA折纸骨架研究了室温下捕获免疫球蛋白Gs（IgGs）的瞬时构象。研究人员首先建立了IgG亲和力在单分子水平上几十纳米范围横向距离和力的依赖性，并利用高速AFM成像系统测量了IgG亲和力大小，研究发现IgG可以响应从短到长的表观距离，呈现从高密度到远距离伸展的灵活构象。这为包括诊断检测和癌症免疫疗法在内的应用提供了思路，同时也增加了在单分子水平上对抗原抗体间相互作用机理的理解。

然而要精确确定抗原颗粒大小、抗原之间的间距以及每个颗粒抗原的数量以最佳地刺激B细胞（通过其B细胞受体与目标抗原结合）依然是一个巨大的挑战。研究人员曾尝试用各种合成颗粒，如聚合物、脂质体或自组装蛋白质来制造亚基疫苗，但用这些材料无法像DNA折纸那样精确地控制病毒蛋白质的位置。最近麻省理工学院的研究人员基于DNA折纸设计出了一种类似HIV的颗粒［23］，由于抗原可以按照预先的设计附着在DNA折纸的任何位置，它们以精确的方式排列，以激发强烈的免疫反应。Bathe和Irvine开始使用这些DNA支架来模拟病毒和疫苗的颗粒结构，研究人员设计了与典型病毒相似大小和形状的二十面体颗粒。他们将一种与Gp120蛋白相关的工程HIV抗原以不同的距离和密度附着在支架上。他们发现产生最强B细胞反应的疫苗不一定是那些将抗原尽可能紧密地包裹在支架表面的疫苗。目前研究人员正在努力尝试用这种方法来开发SARS-CoV-2的潜在疫苗，并且他们预计该疫苗可以用于多种病毒性疾病。

2 DNA折纸用于药物运输

DNA折纸作为运输载体在体外的设计已经有了很多的研究工作，DNA折纸用于体内的药物运输最近也有了很多的研究。研究人员利用DNA折纸向体内运输红霉素［24］。他们首次研究了不同形状的DNA折纸（如三角形和四边形等）在肿瘤移植小鼠体内的生物分布以及肿瘤积累，实验发现具有不同形状的DNA折纸会朝向肿瘤细胞运动并且很快在肿瘤区域累积。三角的DNA折纸在肿瘤细胞处累计最多，相比于没有装载药物的折纸，载药的折纸表现出明显的治疗效果，并显著降低了癌症细胞的耐药性。说明DNA折纸是一种有效的生物相容性好的药物载体。

除了将纳米颗粒和高分子与DNA折纸连接外，有学者又发现了DNA硅化折纸术［25］。在实现DNA表面包覆二氧化硅的同时依然保持着DNA的组装结构，并有效提高组装体的稳定性。他们首先基于分子动力学模拟设计了两种硅和磷酸前躯体,使得硅能够成功地沉积到DNA骨架的表面中；然后基于各种DNA折纸模板，合成了不同尺寸的纳米结构，促使DNA-SiO2的杂化结构稳定性成倍提高，从而使得DNA-SiO2复合结构能够更好地作为药物分子的三维载体。

为了能够更多地装载药物分子，科学家们进一步将多面体DNA折纸框架为模块［26-28］，将待装配的纳米粒子作为药物分子装入DNA折纸框架中，通过对DNA折纸框架的装配来实现对内部所包含纳米粒子的间接组装。研究人员选用四面体、八面体和立方体等三种具有不同顶点数目的DNA框架，通过顶点与顶点之间组装得到一系列对称性不同的晶体结构。研究发现利用八面体DNA折纸结构可以获得高度有序的三维晶体，研究组进一步将金纳米颗粒、量子点以及生物酶装载在DNA折纸框架中，随DNA折纸框架结构的装配实现了不同对称性结构的自组装。这种基于DNA折纸术的框架结构将有助于发展纳米机器人在药物输送等方面的应用。

当纳米粒子或高分子与DNA折纸固化后还需要把装载的分子进行释放，以实现药物缓释的功能。最近，研究人员设计了具有立方中空结构且含有出口的“纳米盒”［29］，并演示了这些纳米盒是如何以可控的方式携带和释放DNA涂层纳米颗粒。与固态纳米结构相比，中空纳米结构具有不同的光学和化学性质，而且这种中空结构中引入的表面开口（气孔）随机分布在表面上，通常控制这些孔洞的大小、形状和位置就可以控制纳米粒子的进出。在实际应用中，例如加载和释放纳米颗粒和化学小分子，就需要对表面开口进行高度控制。这种立方中空结构可应用于生物医学、传感和催化等领域。

为了使DNA折纸和特定分子的结合更加具有特异性，有人将单股DNA折叠起来，形成简单的微观工具，如转子和铰链［30］。他们甚至用DNA构建了一个“特洛伊木马”，用于向癌细胞输送药物。研究小组使用DNA折纸制作了杆、转子和铰链。然后，他们用坚硬的DNA杠杆将纳米级部件连接到由浸渍有磁性材料的聚苯乙烯制成的微型珠子上。通过调整磁场他们发现可以命令粒子来回摆动，组件在不到1 s的时间内执行了指示的动作。

将DNA折纸作为载体进行纳米药物输运的限制因素之一是当DNA纳米结构被置于体内时，很容易被酶消化或随pH值变化而降解。因此科学家们尝试合成了具有特定分子序列组成和长度的类肽生物来保护DNA［31-32］。研究人员合成了两种用于保护DNA折纸的类肽结构：刷子型和嵌段型。这两种结构都有一个DNA结合域(与负电荷的DNA结合的正电荷部分)和一个水溶性域(确保DNA 稳定所需的水分子包围的部分)。研究人员设计了八面体形状的DNA折纸，该折纸具有较高的机械稳定性，并具有较大的开放空间，可用于运载纳米级货物，多肽包裹折纸并将其置于不同的生理条件后，折纸依然能够保持完整的结构，而且可以为生物医学应用添加不同的化学功能。

3 DNA折纸在生物材料及其它方面的应用。

随着DNA折纸技术的发展，单链DNA分子可以被折叠成各种不同的纳米结构。除了在靶向输运药物的应用外，DNA折纸还发展成为一种潜在的生物材料。

最近有学者将血红素修饰的富G核酸序列短链定点互补到三角形DNA纳米结构上，修饰血红素的富G序列作为DNA酶，催化过氧化氢氧化苯胺分子形成苯胺自由基。自由基进一步耦合成苯胺二聚体，连续的氧化偶联反应促使了聚苯胺的形成。这种合成的生物高分子聚合物有望在电子、传感器和能源存储等领域应用［33］。另外，Zhao等［34］利用DNA折纸技术获得长方形纳米结构，预先设计该纳米结构表面所有位点和序列以及适配体的种类、位点分布和密度，进一步将凝血酶核酸适配体杂交组装到纳米结构表面形成阵列。这种纳米抗凝剂能够有效识别结合凝血酶，稳定抑制凝血酶的活性而产生抗凝血的效果。同时，可通过适配体互补配对链的加入，抑制适配体与凝血酶的结合从而能够快速解毒并恢复凝血酶功能。研究团队在凝血酶/纤维蛋白原混合溶液、小鼠血浆、人血浆和小鼠活体中进行测试，这种DNA折纸抗凝剂均显示出其良好的抗凝性能。

有研究用DNA序列诱导了水凝胶的结构转变，展示了一个生产没有繁琐电线、电池或其他约束的“软”机器人和“智能”医疗器械的新策略［35］。他们使用了名叫“发夹”的特定DNA序列，让1 cm尺寸的水凝胶样品膨胀到100 cm。该反应能被另一种名为“终结发夹”的DNA序列终止。为了控制目标水凝胶在不同部位发生形状变化，他们采用了一种类似于制作微型复杂芯片的摄影构图技术为了让DNA对特定的操作有响应，水凝胶的不同区域植入了不同的生物化学模式。为了确认DNA 控制水凝胶相应部位激活的能力，研究人员让DNA 序列控制水凝胶“开花”。每朵“花”有两组“花瓣”，每组被设计成只对一种DNA序列有反应。用两种DNA序列处理时，所有花都做出合拢“花瓣”反应，单独用一种DNA序列处理，则对应的一组“花瓣”展开。该技术采用软性材料组装运动部件，将来可广泛地应用于智能材料和复杂程序执行器等领域［35］。

DNA折纸最大的优势就是精准寻址，DNA折纸结构的精确位置上载带荧光基团，然后将DNA折纸结构放置在玻璃片上。通过这种纳米技术，研究人员就可以验证高于衍射极限的分辨率［36］。在癌组织中，BRCA1和HER2之类的生物标志物可以预示疾病的发病或发展，并且可能有助于诊断、预后和治疗，基于DNA的成像探针标记这些蛋白：抗体末端带有一段DNA链（对接链），可以与携带荧光探针的DNA链（类似于荧光染色中的二抗）相互补。每个感兴趣的生物标志物都有自己的对接链，可以添加、成像或删除DNA荧光探针。然后叠加不同生物标志物的图像以获得组织的复合图像。利用这种方式，可以同时研究多个生物标志物，同时不损伤组织样本。DNA纳米结构也可用于构建用于治疗或诊断的传感器、药物和疫苗。他们的研究目标是制造药物纳米片：在细胞内根据需要，使用DNA产生药物的DNA折纸纳米胶囊。

DNA折纸内在纳米尺度寻址能力还允许基于蛋白质结合的隐写术，Zhang等［37］研究了DNA折纸密码学（DOC），利用M13病毒支架折叠成纳米级自组装的类似于子囊的模式进行安全通信，可构建一个超过700位的密钥，可确保传输信息的完整。虽然与电子计算机相比，解密时间较长，但DOC加密技术为广泛使用的AES系统提供了全面、强保护的生物分子解决方案。有学者设计了含有硫醇基团的DNA链与DNA折纸模板上的延伸进行杂交。其中硫醇基团对金属具有很强的亲和力。组装在DNA折纸上硫醇化的DNA链可以结合金属离子，并在随后的氧化还原反应中形成金属氧化物纳米簇。因此金属氧化物纳米簇可以位于DNA折纸结构的特定区域，从而在DNA折纸上实现金属氧化物纳米簇的定点制造，可以将这种方法推广到任意几何形状和各种无机材料的图案化，这将有助于生成复杂且精确排列的组件，以用于定制功能纳米体系结构［38］。

4 小结和展望

DNA纳米技术因其具有可编程寻址性，一定的分子携带量和良好的生物兼容性成为多学科交叉研究的热点。DNA折纸技术的快速发展在生物、化学和医学等领域有巨大的应用潜力，如可制备基于DNA折纸的各种生物材料，研究载带有特异性药物的纳米结构载体；将DNA纳米机器按照研究人员的指令精确可控地完成各种任务；利用肿瘤标志物、基因等各种疾病的相关指标进行早期检查；用DNA折纸模拟病毒进行疫苗研发，这些都是DNA折纸术独特的优势。

虽然DNA纳米技术发展很快，但仍面临诸多挑战，如DNA合成的高成本，低产出率，目前无法做到大规模的量产［39］。另外一个问题是可以被附着到DNA上的材料种类比较少，研究人员还需要扩大折纸设计可以使用的材料范围，或者更新设计程序。目前折纸最大的限制还是对自组装过程的控制不足。随着DNA折纸结构越来越大，错误折叠的几率会大大增加。同时需要改进和完善折纸设计和制备的技术，以组装更复杂的折纸纳米结构。可喜的是最近颜颢团队描述了一种能实现DNA折纸结构设计自动化的方法［40］，一种名为PERDIX（Programmed Eulerian Routing for DNA Design using X-overs）的程序能够承担包括三角形网、正方形和蜂窝状几何图形等15个不规则设计对象不同形状参数的自动序列设计。极大地加速和简化了制作所需的形式，做到画得出来，就做得出来。这种方法为非专家提供了容易合成复杂纳米结构的方法，有助于推动该领域的发展。