作物基因克隆技术应用进展

刘雨菲

(西南大学，重庆 400700）

基因克隆技术是19世纪70年代初开始发展起来的一项研究技术。它是研究某一特定基因的表达和功能研究的第一步。基因克隆技术的发展为作物研究提供了新的技术方法和研究方向。研究人员利用作物基因克隆技术，通过改变基因型实现了农作物产量、品质、抗性等多种性状的改良，显著提高了农作物的质量。随着基因克隆技术的不断发展并投入实践应用，关于基因克隆的技术研究也在不断改进。目前几乎作物研究的每个领域，都有基因克隆技术的身影。

作物基因的克隆技术是作物育种研究的重要组成部分。主要内容是鉴别分离突变体特异基因并得到完整的基因序列种，进行基因定位，筛选有利性状，最后应用到作物生产实践中。作物基因克隆技术通常分为两种。相对比较传统的研究途径的是正向遗传学方式。反向遗传学途径是新型研究方法，它是先获得遗传基因片段，反向研究基因。本文主要从几种基因克隆技术的角度出发，来介绍作物基因克隆技术的研究进展，并展望了作物基因克隆技术的发展前景。

1.常用传统基因克隆技术

1.1 功能克隆

功能克隆是出现最早的基因克隆技术之一。它主要通过研究表达的异常蛋白质，在已知遗传损伤所引起的蛋白质缺陷信息的情况下，进行基因定位并克隆。步骤的关键是先已知蛋白质，再将其的mRNA反转录成cRNA，然后作为探针，从而从基因组中克隆到所需基因。

更有趣的是，当获得某一个植株的相似基因，且核苷酸序列高度保守时，也可以通过利用这些已知基因片段，去筛选未知基因库，从而分离出未知新基因。周兆斓等利用Kond等克隆和测序编码了水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组，之后将其导入甘薯、马铃薯、茄子等多个作物，极大地改善了作物的抗虫能力。

功能克隆是人们在克隆领域摸索出第一种最基本的克隆方法，它在作物基因克隆的研究中有重要地位。功能克隆是简单实用的方法，但是它需要已知基因信息才能进行克隆，因此最初应用功能克隆方法的时候，具有很大的局限性。

1.2 定位克隆

定位克隆又叫图位克隆，是人们研究出的可以克服基因编码序列未知对功能克隆限制性的一种克隆方法。定位克隆的主要方法是根据目标基因在染色体上的表达位置进行基因分离，即通过分子标记技术将基因在染色体精确定位，构建相关基因组文库，利用探针筛选获得目的基因。

定位克隆在作物基因研究领域中应用很多，其中以研究抗病基因为主。早在21世纪初，定位克隆就应用在玉米茎基腐病抗性基因的研究中。2016年，黄雅敏等人在水稻叶片早衰的研究中对突变体psls1的进行定位并克隆。

当编码序列不清楚的情况下无法进行功能克隆时，定位基因克隆技术的优势就十分明显。但定位克隆主要适用于基因组小的作物，像玉米、小麦这一类基因组大且构建图谱复杂的作物如，果采用这种方法会困难很多。但近年来随着基因组学的发展，大多数作物的基因研究已经非常深入，定位克隆也有新的发展。

1.3 表型克隆

有些作物的遗传机理复杂，很难分析它的基因产物，进行分离定位鉴定也十分烦琐困难，但其在表型上有明显差异。在多次尝试以后，1995年首次有人提出了表型克隆。它主要是利用作物表型的差异来克隆作物基因。

目前人们已通过表型克隆的方法筛选出了多个作物的目的基因，如近年来水稻中得到的短根突变体ksr8和温度敏感型黄叶突变体yl2(t)等。

表型克隆是一种极具发展潜力的技术方法，它利用的是连锁作图的方法，但与定位克隆不同的是，表型克隆不需要通过遗传标记进行定位分析，更省时省力，大大提高了基因克隆速度。但是，表型克隆每次试验分离鉴别一部分基因片段，可能对于其他区域序列的敏感性会有所差异。

2.新型基因克隆技术

2.1 DNA芯片技术

DNA芯片技术又称生物芯片技术，它是由核酸片段如以特定荧光标记的不同的寡核苷酸探针，与游离靶序列杂交，或生物集成膜片上的固定的不同靶分子与游离的探针杂交，然后进行杂交信号的检测。

这项技术在作物中主要用于基因表达的研究。DNA芯片技术可有助于更了解生物在不同阶段和生理状态下的表达基因，更好地研究作物生长发育和病变过程基因表达的内在机制。2014年，陈建省等人利用该技术与传统分子标记结合，构建小麦遗传图谱以及QTL定位分析。2019年，贺超等人在基于基因芯片的研究中，进行了水稻胚乳发育相关基因生物信息学分析。

DNA芯片技术的出现是基因克隆研究史的一个重要节点。它有很多优点，如检测速度快、效率高、适用范围广、容量大。近些年各学科交叉融合发展，随着未来技术的提高，DNA芯片技术在作物基因研究领域会有更多重要的应用。

2.2 PCR扩增技术

PCR扩增技术的前提是已知克隆基因的基因序列。已知作物基因序列以后，根据已知基因的序列设计并合成引物，当克隆该基因时可先提取相关基因序列，然后进行PCR扩增，对扩增的基因片段进行纯化再连接到适宜的载体上。

目前PCR技术在作物基因克隆方面已经得到大量应用。2015年，姜婷等利用实时定量PCR对胁迫下玉米内参基因稳定性进行了筛选验证。2021年陈璨等在研究Acc1内参系统稳定性时也利用了此方法。

PCR扩增技术操作简单，高效经济且准确可靠，特别是在作物抗病性基因检测分析和定位和转基因植物鉴定方面有重要意义。

2.3 同源序列克隆

同源序列克隆是通过设计引物利用被克隆基因编码序列同源性完成基因克隆。它克服了传统克隆耗时耗力的问题，在作物基因克隆技术的应用中具备一定的优越性。

同源序列克隆方法在水稻、马铃薯、番茄、小麦等作物中已经有了较多应用，特别是野生稻的研究。2004年，杨明挚在野生稻中克隆了抗稻瘟病基因。2009年，崔玲玲通过LA-PCR扩增技术克隆了白叶枯病抗病基因RPS2。2014年，徐靖等通过T/A克隆技术，获得了与抗病基因STK类相似的序列。2021年，陈立杰等人在对水稻OsUCH-L5基因试验中也应用了该方法。

在同源序列克隆实际应用时需要注意如何确定获得是真正的目的基因。这就需要考虑克隆中PCR的检测时引物的设计以及对获得的RGA后续的检验，进而作出正确判断。同时，在之后的研究中，也要更多地运用现代新的分子生物技术来协助，使同源基因克隆的方法更加优化，效率进一步提高。

3.结语

基因克隆技术已经发展了数十年，本文中出现的只是其中的一部分，相同的是，它们在作物研究包括作物病理学研究、作物基因表达研究等领域中都起到了巨大的作用，为作物育种提供了宝贵的基因资源，它们中的许多方法技术都已经得到了广泛应用，发展潜能是巨大的。

展望未来，作物基因克隆技术的发展与创新是多方面的。随着技术的不断进步，对于作物功能基因的研究越来越定量化、综合化。将对单个基因的调控研究上升到许多基因的综合调控，可以更好地发展利用功能基因改良作物性状相关研究。作物陆续完成全基因组测序，这对作物遗传改良的研究是十分有利的。作物基因研究仅仅靠之前的人为操作是不行的，未来的作物基因克隆技术研究将越来越多地通过计算机等现代电子技术，在基因研究方面实现突破。随着基因研究的进步，加速基因克隆策略将会大量应用到未来的研究中。

作物基因克隆技术对于作物研究是至关重要的，未来应始终寻求作物基因克隆技术在作物基因克隆研究领域有更好的发展，在作物性状改良方面有更大的突破。