极化骨髓巨噬细胞移植对CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型的影响

简 迅， 王丹阳， 许燕楠， 陈佳美， 刘 伟， 陈高峰， 张 华， 刘 平， 慕永平

上海中医药大学附属曙光医院， 上海中医药大学肝病研究所， 肝肾疾病病证教育部重点实验室， 上海市中医临床重点实验室， 上海 201203

肝纤维化是多种慢性肝病所致的以肝脏细胞外基质(ECM)过度增生与异常沉积，导致肝脏组织结构和/或功能发生异常改变的病理变化。众所周知，肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发生的关键细胞学基础，而巨噬细胞在HSC的活化过程中发挥关键的作用[1]。肝脏巨噬细胞主要由肝脏Kupffer细胞和浸润的单核巨噬细胞构成。在慢性肝损伤过程中，巨噬细胞可通过释放促炎细胞因子或趋化因子等激活HSC，使其转化为肌成纤维细胞，分泌大量的ECM，最终导致肝纤维化的发生与发展[2]。同时，巨噬细胞具有高度的可塑性，其可根据环境信号快速地在促炎(M1)和抗炎(M2)之间进行表型转换，称之为巨噬细胞极化[3]。M1和M2巨噬细胞具有高度异质性，对纤维化肝脏ECM沉积和组织重建具有双重调节作用[4]。如在细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)或炎症因子等的影响下，巨噬细胞经历经典活化并分化为M1巨噬细胞，分泌炎性细胞因子如TNFα、IL-6以及活性氧等，使M1巨噬细胞在清除病原体的同时引发炎症反应。为了保护宿主免受炎症损害，巨噬细胞可被IL-4和IL-13等替代激活并分化为M2巨噬细胞，产生抗炎细胞因子(如IL-10)，主要参与凋亡细胞吞噬、炎症消退、组织修复和重塑等[5]。目前关于M1和M2巨噬细胞在肝纤维化发生中的作用尚存在分歧，本研究分离大鼠原代骨髓巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDM)，体外诱导分化为M1(M1-BMDM)或M2(M2-BMDM)表型后移植至CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内，观察其对肝纤维化进展的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 生长因子：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)购于Cyagen公司；巨噬细胞集落刺激因子购于Novus Biologicals公司。L929细胞株购于中国科学院细胞库。兔多克隆抗体抗CD11b/c[Alexa Fluor®405](NB110-40766AF405)、小鼠单克隆抗体抗CD68[Alexa Fluor®488](NB100-683AF488)购于Novus Biologicals公司；兔多克隆抗体抗α平滑肌肌动蛋白(αSMA，ab5694)、兔多克隆抗体抗CD68 (ab125212)购自Abcam公司；兔多克隆抗体抗CD163 (16646-1-AP)、兔多克隆抗体抗CD206 (18704-1-AP)、兔多克隆抗体Alb(16475-1-AP)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体(GAPDH, 6000-4-1-1)均购自Proteintech公司。qRT-PCR试剂购自Toyobo公司。

1.2 大鼠原代BMDM分离 参考Davis等[6]的方法，雄性SPF级Wistar大鼠，体质量180～200 g，乙醚麻醉下脱颈处死，75%酒精浸泡消毒30 mim，无菌环境分离大鼠胫骨，高糖培养基冲洗骨髓腔，收集混合液，离心，弃上清。加入10 mL 1×红细胞裂解液吹打混匀，静置3 min，同体积高糖培养基吹打混匀，离心，弃上清。加入10 mL 1640细胞培养基重悬细胞，40 μm细胞过滤筛过滤细胞悬液后进行细胞计数，调整细胞浓度为1×106/mL，即可获得原代BMDM[7]。

1.3 原代BMDM极化 参考Pineda-Torra等[8]的方法。M1极化：在37 ℃、5%CO2培养条件下，采用10%FBS+50 ng/mL GM-CSF+1640培养基培养原代BMDM，72 h换液，第6天加入5 ng/mL LPS培养12 h，第7天即可获得成熟的M1-BMDM。M2极化：在37 ℃、5%CO2培养条件下，采用10% FBS+20% L929细胞培养上清+1640培养基培养原代BMDM，72 h换液，第7 d即可获得成熟的M2-BMDM。

1.4 M1-BMDM和M2-BMDM的免疫荧光鉴定 多聚甲醛固定细胞过夜，0.5% Triton X-100孵育透膜。加入一抗(M1-BMDM：CD11b/c 1∶150，CD68 1∶500；M2-BMDM：CD206 1∶500，CD163 1∶50)37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗。免疫荧光标记二抗室温下避光孵育1 h，PBS清洗。DAPI染核，PBS清洗，封片，Olympus FV10i激光共聚焦显微镜获取图像。

1.5 M1-BMDM和M2-BMDM流式细胞鉴定 参考Mily等[9]的方法。使用FACS流式细胞检测术检测M1-BMDM和M2-BMDM纯度，使用细胞刮板将极化后的细胞收集至1.5 mL离心管中，1500 r/min离心5 min，加入1 mL的1% FBS/PBS混合液(洗涤液)重悬细胞，台盼蓝染色后计数，每管加入1×106个细胞、0.5 μL纯化的小鼠抗大鼠CD32封闭Fc段，4 ℃冰箱孵育15 min后加入1 mL洗涤液，1500 r/min离心5 min，弃上清；每管加入29.5 μL洗涤液后分别加入0.5 μL PE抗大鼠CD45、0.5 μL FITC抗大鼠CD11b/c、5 μL CD68-PE-Vio770(TM)rat、1 μL CD206(15-2)，吹打混匀，4 ℃避光静置30 min；CD68与CD206同型对照样本分别加入5 μL PE-Vio 770 130-113-452、1 μL正常小鼠IgG1 Alexa Fluor®647，4 ℃避光静置30 min。BECKMAN DxFLEX流式细胞仪检测样本，Flow Jo软件分析检测结果。

1.6 实验动物 雄性Wistar大鼠24只，SPF级，体质量160～180 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，生产许可证编号SCXK(沪)2018-0006，上海中医药大学实验动物中心饲养，使用许可证编号SYXK(沪)2014-0008。

1.7 模型制备与分组干预 大鼠随机分为正常组(N,n=6)和模型组(n=18)。模型组以30% CCl4-橄榄油溶液2 mL/kg皮下注射，2次/周，共9周。于第7周开始，模型大鼠随机分为模型对照组(M，n=6)，M1-BMDM组(n=6)，M2-BMDM组(n=6)，各组大鼠在继续CCl4造模的同时，M1-BMDM组和M2-BMDM组予以相应巨噬细胞尾静脉注射，每只细胞注射量为1×106/mL[7]；N组和M组予以等体积生理盐水尾静脉注射。第9周末取材。

1.8 血清生化学检测 血清ALT、AST由上海中医药大学附属曙光医院临床医学检验中心检测。

1.9 肝组织Hyp含量测定 使用碱水解法测定肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量，称取50 mg肝组织后水解，检测步骤按照试剂盒说明书操作[10]。

1.10 肝组织病理和免疫组织化学 石蜡固定组织切片厚4 μm，采用HE、天狼猩红染色。并采用图像分析软件Leica LAS Image Analysis对天狼猩红阳性染色面积进行分析。阳性染色面积百分比=阳性染色面积/图片总面积×100%。免疫组织化学方法参考文献[11]。组织切片脱蜡至水，采用αSMA(1∶1000)、CD68(1∶500)、CD163(1∶1000) 等一抗孵育1 h，HRP标记的二抗(1∶1000) 孵育30 min，洗涤，DAB显色，苏木精-伊红(HE)染色，Leica SCN 400扫描仪扫描。

1.11 实时荧光定量PCR (qPCR) αSMA、TGFβ、TNFα、IL-4、IL-6、IL-10、Col1a1、Col4、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、MMP13、TIMP-1 mRNA表达采用qPCR方法检测。总RNA提取采用RNA纯化试剂盒(Toyobo公司)，mRNA表达检测采用SYBR Green real-time PCR Master Mix (SYBR) (Toyobo公司)，以及ViiATM7 real-time PCR System。引物由Takara公司设计合成。SYBR一步法RT-PCR反应条件如下：42 ℃15 min、95 ℃ 2 min、95 ℃变性15 s，40个循环，60 ℃延伸退火1 min。

1.12 免疫印迹 肝组织采用RIPA 缓冲液裂解，4 ℃12 000 r/min离心10 min，测定上清液蛋白浓度，10%或12%凝胶电泳，转移至Hybond-ECL硝酸纤维膜，封闭，一抗4 ℃孵育过夜，αSMA(1∶1000)、CD68(1∶500)、CD163(1∶1000)、Alb(1∶500)、GAPDH(1∶5000)；二抗(1∶10 000)室温下孵育1 h，ECL显影，自动扫描仪读取每一条带的灰度积分值。

1.2 伦理学审查 本研究经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准，批号：PZSHUTCM190823003。

2 结果

2.1 成功分离大鼠原代BMDM并诱导分化为M1和M2表型 培养至第7天时M1-BMDM和M2-BMDM均呈不规则形态特征。免疫荧光染色显示，M1-BMDM高表达CD11b/c和CD68(图1a、b)，M2-BMDM高表达CD163和CD206(图1c、d)。流式细胞计数显示M1-BMDM为CD45+(98.6%)、CD68+(88.6%)、CD11b/c+(97.7%)(图1e)；M2-BMDM为CD206+(98.9%)(图1f)。qRT-PCR检测结果显示，M1-BMDM CD68 mRNA水平显著上调(P<0.01)，M2-BMDM CD206 mRNA水平显著上调(P<0.01)(图1g)。

2.2 M1-BMDM和M2-BMDM均可抑制肝脏炎症反应和肝纤维化进展 HE染色显示，M组大鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞广泛脂肪变性，汇管区大量炎性细胞浸润；与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组肝细胞脂肪变性及炎症反应明显减轻(图2a)。血清生化学检测显示，与N组比较，M组ALT、AST活性显著升高[分别为(1433.6±310.77) U/L vs (16.6±1.5)U/L, (2311.8±246.20) U/L vs (60.6±12.1)U/L,P值均<0.01]，与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组ALT [分别为(649.29±396.28)U/L、(894.17±348.27) U/L]、AST [分别为(1109.86±695.21) U/L、(1335.83±425.75) U/L]均显著降低(P值均<0.01)(图2c)。

天狼猩红胶原染色显示，M组大鼠汇管区可见大量胶原沉积，部分胶原纤维伸入肝实质，形成完整的假小叶结构。与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组肝脏胶原沉积明显减轻(图2b)。与N组比较，M组肝组织Hyp含量显著增加[(311.26±61.44) μg/g vs (177.32±10.72) μg/g,P<0.01]；与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组Hyp含量均显著降低[分别为(225.08±47.86) μg/g vs (311.26±61.44) μg/g,P<0.05; (211.42±50.51) μg/g vs (311.26±61.44) μg/g,P<0.01](图2c)。与Hyp相吻合，胶原半定量分析显示，M组胶原染色阳性染色面积显著增加(5.00±2.20 vs 1.16±0.20,P<0.01)，与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组肝脏胶原染色阳性面积显著减少(2.38±0.70 vs 5.00±2.20, 2.27±0.61 vs 5.00±2.20,P值均<0.05)(图2e)。

2.3 M1-BMDM和M2-BMDM可显著抑制HSC活化 免疫染色显示，M组肝组织αSMA阳染细胞明显增加，与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组αSMA阳染细胞明显减少(图3a)。免疫印迹显示，M组肝组织αSMA蛋白表达显著增加(P<0.01)，与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组αSMA蛋白表达均显著降低(P值均<0.01)(图3b、c)。qRT-PCR检测显示，M组αSMA、TGFβ1、Col1a1、Col4 mRNA表达均显著增加(P值均<0.01)；与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组上述指标mRNA表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)(图3d)。

2.4 M1-BMDM和M2-BMDM对肝脏巨噬细胞活化、胶原酶及炎症因子表达的影响 免疫染色显示，与N组比较，M组CD68阳染细胞明显增加，而CD163和CD206阳染细胞明显减少。与M组比较，M1-BMDM组CD68阳染细胞改变不明显，M2-BMDM组CD68阳染细胞明显减少；M1-BMDM和M2-BMDM组CD163和CD206阳染细胞均有所增加，尤以M2-BMDM组最为显著(图4a～c)。

免疫印迹显示，与N组比较，M组CD68蛋白表达显著增加(P<0.01)，而CD163蛋白表达显著降低(P<0.01)。与M组比较，M1-BMDM组CD68蛋白表达有降低趋势但无统计学差异(P>0.05)，M2-BMDM组CD68蛋白表达显著降低(P<0.01)，且显著低于M1-BMDM组(P<0.05)；M1-BMDM和M2-BMDM组CD163蛋白表达均显著升高(P值均<0.01)，且M2-BMDM组显著高于M1-BMDM组(P<0.05)(图4d、e)。

MMP及其抑制剂检测显示，与N组比较，M组MMP2、MMP9和TIMP-1 mRNA表达均显著升高(P值均<0.05)，而MMP13 mRNA表达水平显著降低(P<0.01)；与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组MMP2、TIMP-1 mRNA表达水平显著降低(P值均<0.05)，而MMP13 mRNA表达水平显著升高(均P<0.01)(图4f)。

炎症相关细胞因子检测显示，与N组比较，M组IL-4、IL-6、IL-10 mRNA表达水平显著降低(P值均<0.05)，TNFα mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；与M组比较，M1-BMDM和M2-BMDM组IL-6、IL-10 mRNA表达水平均显著升高(P值均<0.01)，且M2-BMDM组显著高于M1-BMDM组(P<0.05)； M2-BMDM组TNFα mRNA表达水平显著高于M组和M1-BMDM组(P值均<0.01)(图4g)。

此外，免疫印迹检测显示，与N组比较，M组肝组织Alb蛋白表达显著降低(P<0.01)；与M组比较， M2-BMDM组Alb表达显著升高(P<0.01)，且显著高于M1-BMDM组(P<0.01)(图4h、i)。

3 讨论

巨噬细胞起源于单核细胞前体，具有吞噬、抗原递呈和分泌等多种功能，在组织稳态和宿主防御中发挥重要作用[12]。由于巨噬细胞不同表型的高度特异性，普遍认为不同类型的巨噬细胞对肝纤维化的进展所带来的影响不同[5,13]。但近年来，大量研究发现M1巨噬细胞同样具有良好的抗炎和抗肝纤维化作用。如Ma等[14]研究表明BMDM体外极化为M1表型后对CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型具有良好的干预作用，而M2-BMDM反而无效。本研究将BMDM极化为M1和M2表型后经尾静脉注入CCl4诱导的肝纤维化大鼠体内，结果表明两者均可显著改善肝功能和肝组织病理，且显著降低肝组织Hyp含量，表明两者均具有良好的抗实验性肝纤维化作用。

HSC在肝纤维化的发生与发展中发挥主导作用[15]，而TGFβ1主要来源于Kupffer细胞，是促进HSC活化和增殖的关键细胞因子[16]。本研究结果表明，M1-BMDM和M2-BMDM注射后均可显著降低肝组织αSMA蛋白水平以及αSMA、TGFβ1、Col1a1和Col4 mRNA表达水平，提示两者均可显著抑制HSC的活化。一般认为M1巨噬细胞主要促进HSC的活化和肝纤维化进展，本研究出现相反的结果，可能与M1-BMDM促进内源性巨噬细胞向纤维化部位募集，而这些内源性巨噬细胞表现为Ly6Clow修复型巨噬细胞表型，并通过产生MMP促进胶原降解有关[14]。

肝纤维化逆转不仅需要抑制HSC的活化，还需要促进ECM的降解，MMP家族在此过程中发挥关键作用。肝脏巨噬细胞是MMP的主要来源，特定的亚型通过分泌不同的MMP增强ECM降解以促进纤维化的消褪[17]。如M2巨噬细胞主要分泌MMP-9、MMP-12、MMP-13等促进活化的HSC凋亡以及纤维化消退[18]。本研究结果显示，M1-BMDM和M2-BMDM注射后，均可显著促进肝脏CD163和CD206的蛋白表达水平，M2-BMDM还可显著降低CD68蛋白表达，且两者均可增加MMP9、MMP13 mRNA表达水平，显著降低 MMP2和TIMP-1 mRNA表达水平。提示M1-BMDM和M2-BMDM均可改善肝脏炎症环境，促进肝脏M2巨噬细胞增殖并分泌MMP9和MMP13以促进胶原降解。

此外，一般认为TNFα和IL-6主要来源于M1巨噬细胞，发挥促炎作用[19]，而IL-10主要来源于M2巨噬细胞，发挥抗炎作用[20]。但TNFα和IL-6在肝损伤再生过程中也发挥关键作用[21]，研究表明，肝切除术后2 h左右，肝脏TNFα水平明显上升，随后IL-6水平显著增加[22]，同时，IL-6基因敲除小鼠表现出明显的肝再生受限[23]，提示TNFα和IL-6缺失可延缓肝脏再生[24]。这一观点与本研究结果相吻合，即M1-BMDM和M2-BMDM注射后均可显著增加IL-6、IL-10的mRNA表达水平，且两者在M2-BMDM组显著高于M1-BMDM组，且M2-BMDM还可显著提高肝组织TNFα mRNA以及Alb的蛋白表达水平，提示M1-BMDM和M2-BMDM不仅能够抑制肝脏炎症反应和纤维化进展，后者还可能促进肝细胞的增殖和分化。

综上所述，巨噬细胞在生理和病理条件下对肝脏稳态的调节发挥重要作用[25-26]。M1-BMDM和M2-BMDM对实验性肝纤维化均具有良好的干预效应，两者均可抑制肝脏炎症反应和HSC活化，促进抗炎M2巨噬细胞活化。此外，M2-BMDM可能还可抑制促炎M1巨噬细胞活化及促进肝再生，因此其综合干预效果更佳。本研究尚处于初期阶段，M1-BMDM和M2-BMDM注射后在体内的分布过程尚不清楚，其治疗肝纤维化的内在机制仍有待深入研究；此外，虽然相对于模型组来说，M1-BMDM和M2-BMDM均具有良好的抗肝纤维化作用，但两者是否优于M0，尚有待今后实验予以完善。此外，M1和M2巨噬细胞只是巨噬细胞活化的两种极端状态，且M2巨噬细胞可分为3 个亚群：M2a、M2b和M2c，不同亚型的功能也有差异[27]。还有学者认为肝纤维化恢复期的Ly6C+单核细胞具有与M1/M2 不同的表型[28]。因此，目前对于肝脏巨噬细胞表型转换的潜在机制还缺乏充分的认识，未来需要对肝巨噬细胞的基因组和表型进行深入的研究，为肝纤维化的临床治疗提供科学依据。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：慕永平、刘平等负责课题设计；简迅、王丹阳、陈高峰负责实验实施、资料分析以及撰写论文；许燕楠、陈佳美、刘伟等参与收集数据，修改论文；张华负责医学统计；慕永平负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。