小麦TaPP2-A13基因的表达响应逆境胁迫并与SCF复合体接头蛋白TaSKP1相互作用

孟钰玉 魏春茹 范润侨 于秀梅,,* 王逍冬 赵伟全 魏新燕 康振生 刘大群

1 河北农业大学生命科学学院 / 河北省植物生理与分子病理学重点实验室, 河北保定071001; 2 河北省农作物病虫害生物防治技术创新中心, 河北保定071001; 3 西北农林科技大学植物保护学院 / 旱区作物逆境生物学国家重点实验室, 陕西杨凌712100

F-box蛋白是 SCF (SKP1-Cullin-F-box) 类 E3连接酶的重要组分。第一个F-box基序于1996年在Cyclin F蛋白的N端被发现, 并因此而得名[1]。作为SCF复合体中特异性识别待降解底物的决定性蛋白,F-box蛋白广泛地存在于植物中, 负责调控植物的生长发育、激素信号传导、自交不亲和及抵御胁迫等多个代谢过程。拟南芥(Arabidopsis thaliana)F-box蛋白 Hawaiian skirt和 UFO (Unusual floral organs)均参与花发育的过程[2-3]; 生长素受体TIR1和茉莉酸信号受体蛋白COI1 (Coronatine-insensitive 1)均由F-box基因编码, 能与多种蛋白形成SCFTIR1和SCFCOI1, 继而在植物生长发育及激素介导的生物/非生物逆境过程中发挥作用[4-5]; 植物的自交亲和/不亲和受雌蕊专化的S-RNase基因和多个花粉专化的S-位点F-box(SLF)基因共同调控。矮牵牛(Petunia inflata) F-box基因PiSLF2(S-locus F-box 2)编码的花粉 S-决定因子可与花柱 S-决定因子发生相互识别,从而导致配子体的自交不亲和[6]。据报道, 目前鉴定了17个SLF基因, 其中至少7个参与花粉的专化性识别[7]; 在烟草(Nicotiana tabacum)中过表达小麦F-box基因TaFBA1可增强烟草的抗旱性及对热、盐和氧化胁迫的抵抗力[8-11]; F-box蛋白MAX2 (More axillary 2)不仅参与植物的发育, 而且在抵御病原细菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae,P. syringae)和胡萝卜果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum,P.carotovorum)侵染及盐和干旱胁迫过程中发挥作用[12]; F-box基因CPR30在拟南芥抵御病原细菌P.syringae的入侵过程中起着负调控作用[13]; 葡萄(Vitis vinifera) F-box基因BIG-24.1不仅受灰霉菌(Botrytis cinerea)的强烈诱导, 对UV-C、伤害、SA、ABA、MeJA、乙烯等非生物胁迫和激素也反应强烈[14]。由此可见, F-box家族在植物中发挥着广泛而重要的作用, 近年来对其在抗病和抗逆中的作用引起愈加广泛重视。

韧皮部为植物远距离信息传递和大分子物质的运输提供了一条有效的途径, 同时韧皮部也是植物防御病原物侵染的战略要地。韧皮部蛋白 2(Phloem protein 2, PP2)是存在于植物韧皮部汁液中的一种最丰富和神秘的蛋白质, 以二聚体存在, 是具有几丁质结合功能的特殊凝集素[15]。韧皮部蛋白AtPP2-B11参与了拟南芥对干旱胁迫的响应, 且发挥负调控作用[16]; 拟南芥中 PP2-A1编码韧皮部凝集素类似蛋白, 研究发现该蛋白具有分子伴侣和抗真菌侵染的双重作用[17]; 南瓜(Cucurbita maxima)的韧皮部分泌蛋白 PP2可以将细菌和真菌固定在交联的细丝上, 从而封闭受伤的韧皮部筛管, 使之免受病原菌的进一步侵染[18]; 黄龙病是柑橘(Citrus reticulate)上发生的一种世界级毁灭性病害。长春花(Catharanthus roseus)作为柑橘黄龙病的理想研究材料, 在受到黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas)感染后, 长春花中的PP2类蛋白呈现强烈诱导表达, 这可能导致胼胝质沉积, 筛孔堵塞筛孔, 从而阻止病原菌的侵染[19];此外, PP2类蛋白CsPP2B15在高感CLas的品种锦橙(Citrus sinensis)嫩叶中受 CLas诱导显著上调表达, 而在耐病品种酸柚(Citrus grandis)的嫩叶中受CLas诱导显著下调表达[20]; 苎麻(Boehmeria nivea)中鉴定了15个PP2蛋白, 这些蛋白的编码基因在响应非生物逆境、昆虫及机械伤害的过程中呈现不同的反应[21]。以上报道表明, 韧皮部蛋白2在抵御病原菌侵染, 昆虫和机械伤害及非生物胁迫中均发挥重要作用。

综上, F-box蛋白家族尤其韧皮部蛋白2亚家族(F-box/PP2, FBP)在植物抵御病原菌侵染和非生物胁迫过程中发挥了重要的调节作用。FBP成员在小麦中的功能如何, 是否参与小麦抵御生物及非生物胁迫过程, 目前尚未见报道。鉴于此, 本研究以小麦抗叶锈病近等基因系 TcLr15为材料, 在获得小麦TaPP2-A13基因全长编码区的基础上, 借助生物信息学分析、qRT-PCR、亚细胞定位、酵母双杂交(Yeast 2 Hybrid, Y2H)、双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)等技术, 明确该基因在逆境胁迫下的表达模式, 确定其亚细胞定位,并获得与之互作的蛋白。研究结果将拓宽小麦中F-box家族基因的功能认识, 为深入解析TaPP2-A13在小麦抵御生物和非生物胁迫中的作用机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 小麦和叶锈菌材料及处理方法

小麦抗叶锈病近等基因系TcLr15、小麦高感叶锈病品种郑州 5389、供试叶锈菌株 05-19-43②和05-5-137③均由河北省农作物病虫害生物防治技术创新中心提供。

郑州 5389用于扩繁叶锈菌株 05-19-43②和05-5-137③的夏孢子, 方法参照 Kolmer[22]进行。小麦 TcLr15幼苗分别进行叶锈菌(05-19-43②和05-5-137③)侵染、激素(100 μmol L−1ABA、200 μmol L−1MeJA 和 2 mmol L−1SA)和非生物逆境(10%PEG、7 mmol L−1H2O2和 300 mmol L−1NaCl)处理,取样时间及处理方法同于孟钰玉等[23]的方法。

1.2 TaPP2-A13基因全长扩增

以小麦 TcLr15一叶一心期的叶片 cDNA作为PCR扩增的模板。自小麦转录组数据库 ExpVIP(wheat expression browser, http://www.wheat-expression.com/)中挖掘到 1条基因(TraesCS2D02G397700), 该基因与粗山羊草AetPP2-A13-like基因(GenBank登录号为 XM_020331589.1)同源性高达 100%, 以此序列作为引物设计的模板, 设计克隆引物TaPP2-A13-F和TaPP2-A13-R (表 1)。PCR反应总体系20 μL: cDNA模板1.0 μL、上、下游引物(10 μmol L−1)各 0.5 μL、2×EsTaqMaster Mix 10 μL、ddH2O 8 μL。PCR 扩增程序为 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s,58 ℃ 3 0 s, 72 ℃ 1 min, 33个 循 环; 72 ℃ 1 0 min。扩增获得的目的片段与 pMD19-T载体连接, 构建pMD19-T-TaPP2-A13质粒,然后将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。菌落PCR鉴定为阳性的克隆送至北京中科希林生物科技有限责任公司进行序列测定。

表1 本实验中涉及的引物信息Table 1 Primer information used in this study

1.3 生物信息学分析

DNAStar软件将TaPP2-A13基因的编码区翻译为蛋白质序列; ProtParam (https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)用于分析蛋白质的分子量和等电点; ProtScale (https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)用于预测蛋白疏水性/亲水性; SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)用于分析蛋白质的保守结构域; SOPMA (https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/)和 Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/)分别用于预测 TaPP2-A13蛋白的二级结构和三级结构;SignalP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)用于预测信号肽; TMHMM server v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和ProtComp 9.0 (http://www.softberry.com/)分别用于预测跨膜结构域及亚细胞定位; 利用MEGA7、Clustal X软件和NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的蛋白质数据库进行多序列比对分析和进化树构建。

1.4 TaPP2-A13基因表达模式分析

以1.2获得的TaPP2-A13基因全长序列为模板设计 qRT-PCR引物:TaPP2-A13-qPCR-F/TaPP2-A13-qPCR-R (表1)。RNA提取及第1链cDNA合成同于 1.2。以小麦三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,TaGAPDH,登录号为EU022331.1)为内参基因, 引物TaGAPDH-qPCR-F和TaGAPDH-qPCR-R序列见表1。qRT-PCR参 照 2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGen, 中国)说明书进行。反应程序为94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s, 59.5 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s, 40个 循 环 。TaPP2-A13相对表达量采用 2−ΔΔCt计算, 利用Microsoft Excel 2013进行平均值和标准误差的计算,利用SAS 9.4软件的ANOVA进行方差分析。

1.5 亚细胞定位

根据目的基因编码区和 GFP融合表达载体pSuper1300-GFP序列设计引物TaPP2-A13-GFP-F和TaPP2-A13-GFP-R (表 1)。以 pMD19-T-TaPP2-A13为模板扩增得到带有XbaI和Spe I酶切位点的TaPP2-A13, 扩增体系与程序同于 1.2。扩增产物与pSuper1300-GFP载体连接, 构建GFP融合蛋白的瞬时表达载体。测序验证正确的重组质粒转入农杆菌GV3101菌株, 注射器吸取该菌液注入6～8周龄的烟草叶片。25℃培养30 h后, 以GFP-HQ荧光滤光块(激发滤色镜470 nm/40、分光镜495 nm和吸收滤色镜525 nm/50)在尼康倒置显微镜Ti2-U (Nikon, 日本)下观察GFP绿色荧光, 以确定TaPP2-A13的亚细胞定位情况。

1.6 Y2H分析

用模板 pMD19-T-TaPP2-A13及引物TaPP2-A13-BD-F和TaPP2-A13-BD-R (表1)进行PCR扩增,将酶切位点引入TaPP2-A13两侧, 扩增体系和程序同于1.2。PCR产物经EcoR I和BamH I双酶切后,与同样双酶切的pGBT9 (BD)载体连接, 重组载体命名为pGBT9-TaPP2-A13(BD-TaPP2-A13)。将其转化酵母Y187后, 涂布在SD/-Trp (一缺)、SD/-Trp/-Leu(二缺)、SD/-Leu-Trp-His (三缺)和 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade (四缺)固体培养基上, 观察酵母生长状况,进行毒性和自激活活性验证。

实验室前期已构建 TcLr15接种叶锈菌株05-19-43②的抗叶锈病性酵母 AH109文库[24], 用诱饵载体 BD-TaPP2-A13筛选该文库, 以获取与TaPP2-A13互作的蛋白。具体操作参见 Hong等[25]的方法。以四缺平板上的单克隆为模板, 利用引物TaPP2-A13-BD-F和TaPP2-A13-BD-R进行菌落PCR,确认TaPP2-A13是否存在。再以pGADT7(AD)载体的通用引物AD-F和AD-R (表1)进行增, 鉴定捕获蛋白基因及其片段大小。挑选条带单一( >500 bp)的菌落PCR产物送北京中科希林生物科技有限责任公司测序。

通过蛋白一对一互作方法验证文库筛选结果的准确性。首先将获得的序列在 NCBI数据库进行BLAST比对, 根据比对结果设计各筛选基因的全长扩增引物, 以小麦TcLr15叶片cDNA为模板, 获得各筛选基因的全长编码区。然后将各个筛选基因的编码区序列分别与 AD载体连接, 构建 AD-Prey载体。最后将AD-Prey和BD-TaPP2-A13共转入酵母菌 AH109中, 共转化后的菌液经验证后, 再分别稀释为1∶1、1∶10和 1∶100, 各取0.5 µL稀释后菌液接种至含有X-α-Gal的四缺平板上进一步筛选。

1.7 BiFC分析

根据目的基因编码区和BiFC载体pSPY-NE序列设计引物TaPP2-A13-NE-F和TaPP2-A13-NE-R(表 1)。以 pMD19-T-TaPP2-A13为模板扩增得到带有BamH I和SalI酶切位点的TaPP2-A13, 扩增体系与程序同于1.2。扩增产物与pSPY-NE载体连接,构建BiFC载体pSPY-NE-TaPP2-A13, 随后将其转入农杆菌 GV3101。同时将 pSPY-CE和 pSPYCE-TaSKP1(已构建)分别转入农杆菌GV3101。将转化 pSPY-CE-TaSKP1的农杆菌与转化 pSPY-NETaPP2-A13的农杆菌混合, 以 pSPY-CE 和pSPY-NE-TaPP2-A13混合菌液为阴性对照, 用注射器吸取各混合菌液注入 6～8周龄的烟草叶片。25℃培养 40 h后, 观察荧光信号及其分布, 仪器及设置同于1.5。

1.8 Co-IP分析

以TaSKP1和TaPP2-A13的编码区序列分别设计引物TaSKP1-FLAG-F/TaSKP1-FLAG-R和TaPP2-A13-HA-F/TaPP2-A13-HA-R (表 1)。以 AD-TaSKP1为模板扩增得到带有XbaI的TaSKP1, 以 pMD19-T-TaPP2-A13为模板扩增得到带有MluI酶切位点的TaPP2-A13, 扩增体系与程序同于 1.2。pTF101-3FLAG和pTF101-6HA分别经单酶切(XbaI和MluI)后与扩增产物连接, 构建 Co-IP载体pTF101-3FLAG-TaSKP1和pTF101-6HA-TaPP2-A13,然后将重组质粒转化农杆菌GV3101。

将含有重组质粒的农杆菌(OD600为0.8) 1∶1混匀后注射 6～8周龄的烟草叶片。暗培养过夜, 然后转入正常光周期(16 h光照/8 h黑暗), 25℃培养40 h后, 剪取注射的叶片, 提取其总蛋白。以带有第一抗体anti-HA的beads孵育总蛋白。未经孵育的总蛋白和孵育后的免疫沉淀物分别用anti-HA和anti-FLAG杂交, 以第二抗体羊抗兔IgG-HRP结合第一抗体。杂交完成的PVDF膜漂洗干净后淋上混合液(等体积的 A液和 B液), 于 Odyssey Fc Imaging System(LI-COR Biosciences, 美国)上以固定程序Chemi曝光2 min, 以显示目的蛋白。

2 结果与分析

2.1 获得一个小麦韧皮部蛋白 2编码基因TaPP2-A13

以苗期小麦TcLr15的叶片cDNA为模板, 运用TaPP2-A13-F和TaPP2-A13-R扩增得到一特异条带,大小与预期相符, 测序后确认该序列长度为 1361 bp。在小麦转录组数据库中其 ID 为 Traes CS2D02G397700, 说明该基因序列位于小麦 2D染色体上。在 NCBI网站进行 BLASTx比对, 结果表明, 该序列与普通小麦 D染色体组的供体种粗山羊草(Aegilopstauschii, 登录号为 XP_020187178.1)的PP2-A13-like相似性最高, 为 100%; 其次与二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon, 登录号为XP_010240281.1)中对应序列相似性为 90.66%; 与短花药野生稻(Oryzabrachyantha, 登录号为XP_006652663.1, 84.87%)和小米(Setariaitalic, 登录号为 XP_004976538.1, 80.53%)等禾本科植物的PP2-A13/PP2-A13-like相似性均大于 75%。根据以上比对结果, 将该基因命名为TaPP2-A13(登录号为MT364339)。

TaPP2-A13基因编码一个由 298个氨基酸组成的蛋白质多肽链, 其相对分子量为 33.18 kD, 理论等电点为6.36, 平均亲水系数为–0.322, 属于亲水性蛋白。TaPP2-A13蛋白第22～62位是F-box结构域,第 128～287位具有 PP2结构域, 为 F-box蛋白家族中FBP亚家族。经预测, 该蛋白二级结构中α-螺旋占22.82%, β-转角占6.04%, 无规则卷曲和β-折叠分别为 46.31%和 24.83%。三维结构主要由无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠构成, 与二级结构预测结果基本一致。TaPP2-A13蛋白不含信号肽序列和跨膜结构域, 暗示其既非分泌蛋白, 亦非跨膜蛋白。亚细胞定位预测显示, TaPP2-A13定位在细胞核上。

利用Clustal X软件对小麦TaPP2-A13与其他禾本科植物 PP2-A13进行氨基酸序列比对, 发现各氨基酸序列间均具有较高的相似性, 尤其是在 F-box结构域和PP2结构域 2个区域。F-box结构域共包含41个氨基酸, 其中31个氨基酸是完全保守的, 5个氨基酸位点仅在一个物种(1个在二穗短柄草, 1个在短花药野生稻和3个在玉米)中有差别。PP2结构域共包含 160个氨基酸, 其中 112个氨基酸是完全保守的, 有12个氨基酸是仅在一个物种(1个在二穗短柄草, 1个在 II型少花古尔德草(Dichanthelium oligosanthes), 1个在短花药野生稻, 2个在水稻, 1个在哈氏黍(Panicum hallii), 1个在黍子(Panicum miliaceum), 2个在狗尾草和3个在玉米)中有差别。高度保守的氨基酸说明其对于维持PP2-A13/PP2-A13-like的功能至关重要(图1)。

采用MEGA7中的NJ (Neighbor-Joining)法构建系统发育树(图2)。根据亲缘关系的远近将进化树分为 5个组。与小麦亲缘关系最近的为小麦近缘种属植物, 如粗山羊草、大麦(Hordeum vulgare)、二穗短柄草等, 其PP2-A13位于同一进化分支上(V组)。其中 TaPP2-A13与粗山羊草 AetPP2-A13的亲缘关系最近, 其氨基酸序列完全一致。TaPP2-A13与IV组的玉米、高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italica)和糜子(Panicum miliaceum)等的 PP2-A13亲缘关系次之。稻类和弯叶画眉草(Eragrostis curvula)的PP2-A13聚为一类(III组)。乌拉尔图小麦处于单独的分支, 为 II组。木本植物如胡杨树(Populus euphratica)、小垫柳(Salix brachista)和银叶玫瑰木(Rhodamnia argentea)等及双子叶植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)和石斛兰(Dendrobium catenatum)等的 PP2-A13聚为一类(I组)。I组、II组和III组的PP2-A13序列与第V组相应序列的亲缘关系更远些。

2.2 小麦中 TaPP2-A13在基因水平的表达响应激素处理及生物和非生物胁迫

为了解TaPP2-A13基因受激素诱导表达的情况,分别对小麦TcLr15进行ABA、SA和MeJA处理。经 3种外源激素处理后, 随处理时间延长,TaPP2-A13基因均呈现稳步地显著上升表达趋势。ABA处理0.5 h时,TaPP2-A13基因的表达量与0 h样品无异, 自处理2 h时开始升高, 12 h时的表达量约为0 h样品的5倍, 24 h突然降低至0 h样品的3倍左右, 然后再次升高, 在所取样时间范围内, 48 h时表达量达到最高, 为0 h样品的5.3倍; SA处理小麦叶片6 h时,TaPP2-A13基因的表达量与0 h样品差异不大, 自 12 h开始表达量升高, 24 h时TaPP2-A13基因表达量达到最大, 为0 h样品的6倍,48 h虽然有所下降但仍为对照的5.2倍; MeJA处理后, 小麦TaPP2-A13基因的表达量在6 h时开始缓慢升高, 在所取样品的时间范围内, 48 h时表达量达到最高, 为0 h样品的2.8倍(图3)。经3种抗病/抗逆相关激素处理小麦TcLr15后, SA和ABA可以诱发TaPP2-A13基因更高的表达, 其中, ABA呈现更早的诱发, 而SA诱导TaPP2-A13基因的表达更强。

本研究设置3种非生物逆境处理小麦TcLr15幼苗。在H2O2胁迫下, 随着处理时间延长,TaPP2-A13基因整体呈现下调的表达趋势。0.5 h的表达量与0 h样品几乎无差异, 自 2 h开始表达量持续下降, 至48 h时表达量仅为0 h的1/5; 在PEG模拟的干旱胁迫条件下, 从0.5 h开始TaPP2-A13基因表达量即出现明显下降, 在所取样的时间范围内, 24 h时表达量最低, 仅为对照的3/50; NaCl处理后,TaPP2-A13基因在前3个时间点出现明显地上调表达, 6 h时表达量为0 h的4.8倍, 而后表达量显著下调, 至24 h时达到最低值, 为0 h样品的2/5 (图4-A)。3种逆境条件下, 氧化胁迫和干旱胁迫使TaPP2-A13基因呈现显著地下调表达, 而盐胁迫则诱导TaPP2-A13基因在短时间内显著上调表达。

小麦 TcLr15与叶锈菌形成的感病(05-5-137③)及抗病(05-19-43②)组合中,TaPP2-A13基因均呈现先下调再上调的表达趋势。在抗病组合中, 接种叶锈菌株05-19-43② 6 h后,TaPP2-A13的表达量即开始下降, 12 h达到最低, 为0 h的1/4, 随后开始升高,48 h时的表达量恢复到与0 h样品相同水平, 96 h时升高到0 h样品的2.4倍; 在感病组合中, 接菌6 h的样品表达量与0 h样品无显著变化, 12 h出现显著下调, 之后表达量开始升高, 在取样的时间范围内96 h表达量达到最高值, 为 0 h样品的 4.3倍(图4-B)。比较抗/感病组合间表达的趋势, 发现TaPP2-A13在感病组合各个时间点的表达量均高于抗病组合。

2.3 TaPP2-A13亚细胞定位于细胞核和细胞质中

为明确TaPP2-A13在细胞内发挥生物学功能的场所, 本试验对其亚细胞定位进行观察。结果如图5所示, 25℃培养 30 h时, 阳性对照叶片中的绿色荧光遍布整个视野, 表明实验体系及烟草生长状况均较好。但此时样品中尚无绿色荧光出现。25℃继续培养至48 h时, 在细胞核和细胞质中可见较强绿色荧光。以上观察结果表明TaPP2-A13定位在细胞核和细胞质中。

2.4 TaPP2-A13与TaSKP1在细胞内相互作用

2.4.1 酵母双杂交确定5种蛋白与TaPP2-A13存在物理相互作用 为解析TaPP2-A13在细胞内发挥作用的机制, 拟筛选胞内与其有相互作用的蛋白并进行验证。首先构建诱饵表达载体 BD-TaPP2-A13,将其转化酵母感受态细胞 Y187后涂布于一缺、二缺、三缺和四缺平板上。经验证, 重组质粒对酵母细胞无毒性, 亦无自激活能力。

以BD-TaPP2-A13为诱饵载体, 筛选酵母文库。挑选20个扩增条带单一且条带大于500 bp的克隆进行序列测定。测序结果在 NCBI网站上进行BLASTx比对, 结果表明 11种候选蛋白可能与TaPP2-A13存在相互作用(表2)。其中一部分与植物光合和呼吸作用相关, 如核酮糖二磷酸羧化酶小链(ribulose-bisphosphate carboxylase small chain,RbcS)、核酮糖二磷酸羧化酶活化酶 B (ribulose bisphosphate carboxylase activase B, RcaB)、RUBISCO活化酶 β基因(rca1_betagene for RUBISCO activase beta, TaRca1_beta)、核酮糖活化酶A (ribulose activase A, RcaA)和Fe-S蛋白的前体蛋白(Fe-S precursor protein)等[26-27]。另有一部分与植物生长发育、抗病及激素信号转导相关, 如 SCF复合体骨架蛋白SKP1[28]、UDP葡萄糖类黄酮3-O-葡糖基转移酶 7 (UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase 7, UFGT7)[29]、蛋白磷酸酶(Protein phosphatase 2C 5, PP2C5)[30]、几丁质酶(Chitinase, CHI)[31]和酮酰 CoA 硫醇酶(3-ketoacyl-CoA thiolase 2, KAT2)[32]及 SEC1蛋白家族的 SLY1(SEC1 family transport protein SLY1)[33]等。

根据文库筛选获得序列, 结合实验室前期研究结果, 开展酵母一对一互作验证。构建的重组质粒AD-prey (筛选基因)分别与BD-TaPP2-A13共转化酵母菌株 AH109, 在含有 X-α-Gal的四缺固体培养基上进行回复验证。结果如图6所示, AD-TaPP2C5、AD-TaSLY1、AD-TaCHI、AD-TaRbcS和 AD-TaSKP1分别与 BD-TaPP2-A13形成的 5个组合在含有X-α-Gal的四缺培养基上均能正常生长, 且菌落呈现蓝色, 初步证明 TaPP2C5、TaSLY1、TaCHI、TaRbcS和 TaSKP1与 TaPP2-A13存在物理性相互作用。

2.4.2 BiFC确定TaPP2-A13与TaSKP1存在相互作用 将TaSKP1和TaPP2-A13分别与载体pSPY-CE和 pSPY-NE连接, 构建 pSPY-CE-TaSKP1和 pSPY-NE-TaPP2-A13载体。将 pSPY-CE和pSPY-CE-TaSKP1分别与pSPY-NE-TaPP2-A13混合,注射烟草叶片, 培养40 h后进行荧光观察。pSPY-CE和pSPY-NE-TaPP2-A13形成的阴性对照中无荧光信号, 实验组合中可见绿色荧光信号, 且荧光信号主要集中在细胞核和细胞质(图 7), 表明 TaSKP1与TaPP2-A13存在相互作用。

表2 TaPP2-A13筛选酵母文库的结果Table 2 Results of library screening by TaPP2-A13

2.4.3 Co-IP证实TaPP2-A13与TaSKP1在胞内存在相互作用 构建重组载体 pTF101-3FLAGTaSKP1和 pTF101-6HA-TaPP2-A13, 分别将其转入农杆菌GV3101, 混合2种菌液后共注射6～8周龄本氏烟草叶片。提取烟草总蛋白, 利用 HA和 FLAG抗体分别进行杂交实验。已知TaPP2-A13的预测分子量为33.18 kD, TaSKP1的预测分子量为19.06 kD,载体上HA和FLAG标签蛋白的分子量分别为7.54 kD和 4.06 kD。融合蛋白 TaPP2-A13-6HA和TaSKP1-3FLAG的分子量大小应该为 40.72 kD和23.12 kD。由图8可知, 未瞬时表达TaPP2-A13-6HA和 TaSKP1-3FLAG的烟草叶片, 其全蛋白无杂交的目的条带, 而在瞬时表达 TaPP2-A13-6HA和TaSKP1-3FLAG的材料中, 其全蛋白与 HA抗体或FLAG抗体分别杂交获得目的蛋白。进一步利用带有 anti-HA的磁珠进行总蛋白的免疫沉淀, 沉淀蛋白中富含 TaPP2-A13-6HA和TaSKP1-3FLAG, 说明TaPP2-A13和TaSKP1在植物细胞内是互作的(图8)。

3 讨论

利用同源克隆技术自小麦TcLr15中首次获得了TaPP2-A13基因, 其编码蛋白的 N端为一个保守的F-box结构域, C端具有一个PP2结构域, 属于典型的FBP亚家族。本实验室前期已得到了小麦F-box基因TaFBL14和TaSKP2A[34-35], 这 2个基因与TaPP2-A13虽然同属于 F-box家族, 不同的是,TaFBL14和TaSKP2A的C端含有典型的LRR结构域, 属于FBL亚家族, 同时实验室也已获得了C端含有Kelch结构域的FBK亚家族成员[36]。Zhou等[8]获得的TaFBA1属于FBA亚家族。由此可见, 小麦中存在不同类型的 F-box亚家族成员。各个亚家族成员是否存在功能差异尚未可知。

近年来, F-box蛋白在植物抵御病原细菌和真菌侵染中的作用日益引起关注。例如, F-box基因CPR30在拟南芥抵御病原细菌P. syringae的入侵过程中起着负调控作用[13]; 棉花(Gossypium hirsutum)F-box蛋白GhACIF1通过与GhSKP1互作增强陆地棉对棉花黄萎病致病菌-大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)的抗性[37]; BIG-24.1是分离自葡萄叶片中的F-box蛋白, 当葡萄受到灰霉菌感染时, 叶片及浆果中BIG-24.1的表达量显著上升[14]; 此外, SON1、MAX2、COI1、Nictaba等F-box家族成员在植物抵御病原菌侵染过程中均发挥着重要作用[38-40]。但尚未见 F-box蛋白在小麦抵御叶锈菌侵染过程中发挥作用的报道。本研究对小麦叶片中TaPP2-A13基因受叶锈菌侵染后的表达情况进行分析, 发现随叶锈菌侵染进程的延伸, 该基因在抗病及感病组合中均呈现上调表达, 且在感病组合中呈现更加强烈的上调(96 h时, 感病组合的表达量是抗病组合的2倍)。长春花在遭受黄龙病菌感染后, 韧皮部蛋白基因PP2-B11和PP2-B15显著上调, 而PP2-A1和PP2-A13则下调。PP2-A13在受到不同病原菌侵染后呈现差异的表达模式。柑橘黄龙病致病菌为细菌,而小麦叶锈病菌为专性寄生真菌, 细菌和真菌在侵染植物后引起的抗/感病路径不同, 启动抗病相关基因的表达不同, 这可能是造成相同基因在不同植物-病原物组合中表达模式不同的主要原因。

植物 F-box蛋白也响应各种非生物胁迫过程。例如, FBP7、DOR、MAX2等在响应非生物胁迫方面均发挥重要作用[12,41-42]。TaPP2-A13基因受MeJA诱导呈现上调表达, 在SA、ABA和NaCl处理后呈现先上调后下调的表达趋势, 经H2O2和PEG处理后,TaPP2-A13随处理时间延长总体呈现显著下调的表达模式, 说明TaPP2-A13的表达受到包括叶锈病菌侵染、外源激素和非生物逆境在内的共同影响。相同的结果见于 F-box基因BIG-24.1, 该基因不仅受灰霉菌的强烈诱导, 对 UV-C、伤害、SA、ABA、MeJA、乙烯等非生物胁迫和激素也反应强烈[14]。这说明植物 F-box家族的一些成员参与多种非生物胁迫的调节过程。

本研究试图找到胞内与TaPP2-A13具有相互作用的蛋白。通过筛选抗叶锈病小麦 TcLr15的酵母cDNA文库, 获得了11种可能与TaPP2-A13互作的蛋白。但由于酵母文库筛选方法假阳性率较高, 进一步运用 Y2H 确定 TaPP2C5、TaSLY1、TaCHI、TaRbcS、TaSKP1与TaPP2-A13存在相互作用。Hong等[25]发现 TaKFB1和 TaKFB3经过酵母文库筛选分别获得了 61个和 74个克隆, 进一步验证确定TaKFB1与4个蛋白存在相互作用, TaKFB3与3个蛋白存在相互作用, 且这 2个 TaKFB蛋白都能与TaSKP1s蛋白相互作用。这说明1个F-box蛋白可识别多个底物, 且1个F-box蛋白可能与多个SKP1蛋白相结合。

SKP1是 SCF (SKP1-CUL1-F-box protein)复合体的组分, 能够与F-box蛋白中的F-box结构域直接结合, 从而参与靶蛋白的泛素化过程。经预测,TaPP2-A13和TaSKP1均无信号肽结构, 且TaSKP1的亚细胞定位预测结果为细胞核, 这为二者在空间上互作提供了可能性。据报道, AtPP2-B11能与SCF复合体骨架蛋白 SKP1家族成员 ASK7、ASK18和ASK19互作, 暗示其具有 F-box蛋白的功能。同时过表达牡丹(Paeonia suffruticosa)PSK1基因的拟南芥耐盐性得到显著提高[28], 同样的结论在大豆GmSK1过表达的烟草中得到了印证, 此外, 过表达GmSK1的烟草还表现出对干旱胁迫有较强的耐受性。本研究通过Y2H、BiFC和Co-IP实验证实TaPP2-A13与TaSKP1存在相互作用, 因此推测TaPP2-A13可能为SCF复合体的组分, 通过与TaSKP1结合实现其响应生物/非生物逆境过程的作用。

PP2C5是可以调控植物ABA信号通路的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶, 该酶既影响植物的生长发育,又在植物抵御非生物胁迫和抗病过程中发挥作用[30];SLY1属于SEC1蛋白家族, 其亚细胞定位为高尔基体。酵母中的 SLY1参与了内质网到高尔基体的囊泡运输过程[43]。目前, SEC1家族蛋白的研究主要集中在酵母、线虫(Limnodrilus hoffmeisteri)和大鼠(Rattus norvegicus)中[33], 其在植物中的研究鲜见报道; CHI在植物体中普遍存在, 病原真菌攻击、真菌细胞壁的刺激和乙烯等均能诱导植物体内几丁质酶的快速积累。此外, 几丁质酶也会响应重金属、渗透压和干旱等非生物逆境胁迫[44]。在活体外, 几丁质酶能高度抑制真菌的生长[31]。根据Melchers等[45]的分类方法, 本研究中获得的小麦 TaCHI为 I类几丁质酶。烟草中的I类几丁质酶定位于植物液泡中[46],本研究中获得的 TaCHI亚细胞定位预测也是液泡中。RbcS基因编码的蛋白质已被证明影响 Rubisco的催化效率、组装、活性及其稳定性[47]。研究发现拟南芥中RbcS的表达存在组织特异性且受光的诱导[27]。本文通过Y2H技术证实TaPP2-A13分别与TaPP2C5、TaSLY1、TaCHI和TaRbcS存在相互作用, 该结果仍需其他蛋白互作技术深入验证。

4 结论

自小麦抗叶锈病近等基因系TcLr15中分离了1个小麦FBP亚家族基因TaPP2-A13; 该基因所编码蛋白在小麦近缘种属中的进化比较保守; 定位于细胞核和细胞质上; 受叶锈菌侵染、外源激素和非生物逆境处理后,TaPP2-A13基因表达量呈现上调或下调的显著变化。文库筛选获得11种与TaPP2-A13互作的蛋白, Y2H 验证表明 TaPP2C5、TaSLY1、TaCHI、TaRbcS、TaSKP1与TaPP2-A13存在物理相互作用, BiFC和 Co-IP深入研究确定 TaSKP1与TaPP2-A13存在相互作用。