基于网络药理学和分子对接探讨青龙衣治疗白癜风的物质基础及作用机制

何 婷，王亚楠，王银洁，谢宝琳，徐 静，杨丽娟，莫 婷，杨 森，马 力，高如宏

(1.宁夏回族医药研究所；2.银川市兴庆区健康教育所；3.银川市中医医院，宁夏 银川 750021；4.广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510006)

青龙衣即核桃(JuglansregiaL./JuglansmandshuricaMaxim.)的外果皮，始载于《开宝本草》。青龙衣苦、涩、平，主治脘腹疼痛、泄泻久痢、痈肿疮毒、顽癣、秃疮、白癜风等症[1]。青龙衣治疗白癜风在古今医书中均有记载，《本草纲目》曰：“治白癜风：青胡桃皮一个，硫黄一皂子大。研匀，日日掺之，取效。”回医药经典著作《回回药方》也提到：“青胡桃皮，白矾，荆棘树胶，合用治疗浑身紫白癜风用。”[2]近代亦有临床文献报道使用青龙衣治疗白癜风疾病[3-4]。但青龙衣治疗白癜风的物质基础及作用机制并不明确，且未见相关研究报道。因此，本研究利用网络药理学[5]的方法筛选青龙衣治疗白癜风的关键活性成分，探讨其关键作用靶点和通路，通过分子对接进一步验证关键靶点，初步阐明青龙衣治疗白癜风的物质基础和作用机制，以期为后续实验研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 青龙衣活性成分筛选

通过中国知网(CNKI)、PubMed等数据库进行文献检索，收集青龙衣化学成分，再利用Pubchem、sci-finder等数据库对其结构进行确证，构建化学成分库。用ChemBioDraw Ultar 14.0 将化合物的结构式保存为sdf格式。利用molsof软件(http：//molsoft.com/mprop/)，得到各成分的ADME 参数即吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)及排泄(Excretion)，参数包括OB(Oral bioavailability)、DL(Druglikeness)等。由于青龙衣治疗白癜风为外用剂型，因此以类药性DL≥0.18[6]作为活性成分筛选条件。

1.2 青龙衣活性成分作用靶点收集

Swiss Target Prediction(http：//www.swiss targetprediction.ch/)是基于小分子化合物结构，从2D及3D结构相似性角度，间接预测提交小分子化合物的作用靶点[7]。将“1.1”项下得到的青龙衣活性成分sdf格式导入Swiss target prediction平台，设置种属为“homo sapiens”，进行反向对接，预测青龙衣活性成分作用靶点，选取每个化合物的前15个靶点[8]。

1.3 白癜风疾病相关靶点收集

以白癜风、vitiligo为关键词，分别从TTD数据库(https：//db.idrblab.org/ttd/)，OMIM数据库(https：//omim.org/)，Genecards数据库(https：//www.genecards.org/)收集白癜风疾病相关靶点。设定物种为“人类(Homo sapiens)”，去掉重复后，建立白癜风疾病相关靶点数据库。

1.4 蛋白相互作用(PPI)网络构建与分析

蛋白互作网络(Protein-protein interaction network，PPI network)可帮助预测蛋白质之间的潜在相互作用，有助于从系统角度研究疾病分子机制、发现新药靶点[9]。STRING 数据库(http：//string-db.org)可评估、整合蛋白-蛋白之间的相互作用，包括直接和间接关联[10]。为明确青龙衣化学成分与治疗白癜风靶点之间潜在的相互作用关系，将“1.2”项下筛选出的青龙衣活性成分靶点和“1.3”项下筛选出的白癜风靶点导入 STRING 数据库，限定物种为人类(Homo sapiens)，设置较高置信度(High confidence)≥0.70，除去未相互连接的节点(Node)后，得到靶点互作网络图，保存为TSV格式文件。将TSV导入Cytoscape 3.7.1中，运用CentiScaPe 2.2计算节点度值(Degree)，选取度值大于平均值两倍的靶点作为核心靶点(Hub node)[11]。

1.5 青龙衣治疗白癜风靶点筛选

将“1.2”项下得到的青龙衣活性成分靶点，与“1.3”项下得到的白癜风靶点进行交集，作为青龙衣治疗白癜风的直接靶点。将“1.3”项下白癜风靶点与“1.4”项下得到的核心节点(Hub node)取交集作为间接靶点，合并直接靶点与间接靶点，即得青龙衣治疗白癜风所有可能的作用靶点，利用Venny2.1.0 软件，绘制韦恩图。

1.6 GO功能富集分析

DAVID数据库是强大的基因注释工具，可通过该数据库发掘基因与疾病的相关性，并对相关基因进行富集分析[12]。将“1.5”项下得到的青龙衣治疗白癜风靶点输入DAVID 6.7数据库(https：//david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp)进行GO功能富集分析。限定物种为人类(Homo sapiens)，分别选取生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)以P值升序排列的前10个富集过程，利用GraphGad Prinsm 7绘制GO 2级分类柱状图[13]。

1.7 青龙衣“关键成分-关键靶点”网络构建

将“1.1”项下得到的青龙衣活性成分和“1.5”项下得到的治疗白癜风靶点通过Cytoscape 3.7.1软件构建“关键成分-关键靶点”网络，并运用软件中的CentiScaPe 2.2进行拓扑分析，计算介数中心度(Betweenness centrality)，紧密中心度(Closeness centrality)和节点度值(Degree)，根据3项数值，以均大于中位数的标准筛选青龙衣治疗白癜风的关键活性成分和关键作用靶点[14]。

1.8 分子对接验证

本研究采用薛定谔软件中Maestro的Glide进行对接。从RCSD PDB (http：//www.rcsb.org/)蛋白数据库搜集靶点的蛋白晶体结构[15]，从PubChem Compound(http：//www.ncbi.nlm.gov)下载靶点化合物的sdf格式，准备对接。用Protein Prepare Wizard对蛋白质晶体进行预处理，用LigPrep模块对靶点化合物结构优化，最后用标准精密(Standard precision，SP)分子对接，对接分数(Docking score)绝对值越大，表示结合亲和力越强[16]。将PDB蛋白晶体结构中已有配体作为阳性对照，其与相应靶点PDB蛋白的对接分数为截断值，打分高于截断值的化合物则认为与该蛋白具有较好的结合亲和力。以RMSD<2[17]为阈值评判对接方法的合理性。

2 结果

2.1 青龙衣活性成分筛选

对数据库检索结果进行整理，共收集到92个青龙衣化学成分，符合“DL≥0.18” 的有79个即为青龙衣活性成分，主要集中于萘醌类、二芳基庚烷类、多酚类、萜类、黄酮类等化合物。

2.2 青龙衣活性成分作用靶点筛选

将筛选到的活性成分，输入Swiss Target Prediction 网站进行反向对接，去重复后得到342个活性成分作用靶点。

2.3 白癜风疾病靶点筛选

从TTD数据库中得到9个靶点，OMIM数据库得到1个靶点，Genecards数据库得到783个靶点，去重复后得到790个白癜风疾病靶点。

2.4 PPI网络分析

将STRING数据库得到的蛋白相互作用信息导入Cytoscape进行拓扑分析，结果发现与白癜风发生、发展密切相关的靶蛋白ESR1、EGFR、CXCL8、IL2、JAK2等80个靶点的度(Degree)值均在中位数的2倍以上，表明这些蛋白在PPI网络中具有关键地位，对青龙衣治疗白癜风具有重要意义。

2.5 将青龙衣活性成分对应靶点与白癜风疾病靶点相交集

通过软件Venny2.1.0映射，得到共有直接靶点47个。通过STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用分析，共得到89个核心节点(Hub node)。将化合物靶点与核心节点(Hub node)相交集共得到间接靶点32个，最终确定79个青龙衣治疗白癜风潜在作用靶点，绘制维恩图(见图1)。

图1 青龙衣治疗白癜风的直接与间接作用靶点

2.6 功能注释与通路分析

通过DAVID数据库，对青龙衣化学成分的对应靶基因进行GO功能注释分析(见图2)。GO结果显示79个潜在靶点主要涉及159个GO功能，其中生物过程(BP)富集142个功能过程，主要涉及细胞内信号级联、磷酸盐代谢过程、氮化合物代谢过程的正调控等；细胞组分(CC)相关的富集过程1个，为胞浆过程；分子功能(MF)相关的富集过程15个，主要涉及腺苷酸结合、酶结合、胰岛素受体底物结合一氧化氮合酶调节活性、非膜生成蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等过程。

注：BP：生物过程；CC：细胞组分；MF：分子功能。图2 青龙衣治疗白癜风关键靶点的GO富集

2.7 “关键成分-关键靶点”网络构建

利用Cytoscape对青龙衣活性成分和治疗白癜风靶点进行拓扑结构分析，筛选出关键活性成分21个，关键靶点27个(见表1)。

表1 青龙衣治疗白癜风的关键活性成分和关键靶点

续表1

2.8 分子对接验证

通过文献调研发现，BCL2、EGFR、ESR、ACHE、MAOA、PTPN22(表1加粗)这几个关键靶点与白癫风的发生、发展密切相关，且为目前研究热点；另外醌类化合物为青龙衣的特征化学成分，其含量也较高，可能为青龙衣的药效成分，故选择6个醌类关键活性成分与以上靶点进行分子对接验证。各个靶点PDB蛋白与对应关键活性成分的分子对接得分见表2。

表2 关键活性成分与关键靶点的对接得分

2.8.1 ESR1靶点与关键活性成分分子对接 结果显示，ESR1与1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羟基蒽醌、1-甲基-3,8-二羟基-6-甲氧基蒽醌的对接得分优于配体(见表2)，且均与ESR1的残基GLU353和LEU387形成氢键相互连接，说明化合物与靶点之间有较强的活性，ESR1可能是这3个关键活性成分的作用靶点。见图3、图4、图5。

图3 1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌与ESR1活性位点对接的3D(a)和2D(b)

图4 1,3-二羟基蒽醌与ESR1活性位点对接的3D(a)和2D(b)

图5 1-甲基-3,8-二羟基-6-甲氧基蒽醌与ESR1活性位点对接的3D(a)和2D(b)

2.8.2 MAOA与关键活性成分分子对接 结果显示，MAOA与胡桃醌以及2,3-二甲基-5-羟基-1,4-萘醌的对接得分优于配体(见表2)，且均通过氢键与MAOA残基ASN181相互作用，说明MAOA可能是这两个关键活性成分的作用靶点。见图6、图7。

图6 2,3-二甲基-5-羟基-1,4-萘醌与MAOA活性位点对接的3D(a)和2D(b)

图7 胡桃醌与MAOA活性位点对接的3D(a)和2D(b)

2.8.3 PTPN22与关键活性成分的分子对接 结果显示，PTPN22与胡桃醌以及2,3-二氢-5-羟基-1,4-萘醌的对接得分优于配体(见表2)，且均通过pi-pi共轭与PTPN22残基ARG233相连接，PTPN22残基ARG233、ALA229与CYS231相互作用形成氢键，pi-pi共轭连接和氢键连接增强了化合物与靶点蛋白的稳定性，提高了彼此之间的结合亲和力，PTPN22可能是这两个关键活性成分的作用靶点。见图8、图9。

图8 2,3-二氢-5-羟基-1,4-萘醌与PTPN22活性位点对接3D(a)和2D(b)

图9 胡桃醌与PTPN22活性位点对接的3D(a)和2D(b)

2.8.4 BCL2与关键活性成分分子对接 结果显示，BCL2与1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌和1,3-二羟基蒽醌的对接得分均优于配体(见表2)，且均通过pi-pi共轭与BCL2残基PHE63相连接，通过氢键与BCL2残基ASP70相连接，BCL2可能是这两个关键活性成分的作用靶点。见图10、图11。

图10 1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌与BCL2活性位点对接的3D(a)和2D(b)

2.8.5 EGFR和ACHE与关键活性成分分子对接 结果显示，1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羟基蒽醌、1-甲基-3,8-二羟基-6-甲氧基蒽醌与EGFR的对接得分低于配体(见表2)，说明化合物与靶点之间的活性较弱，这3个关键活性成分的作用靶点可能不是EGFR。同理，2,3-二甲基-5-羟基-1,4-萘醌和2,3-二氢-5-羟基-1,4-萘醌这两个关键活性成分的作用靶点也可能不是ACHE。

3 讨论

白癜风是由于某些不明原因造成黑色素细胞损伤，自表皮脱失而形成的白斑。其发病率约为1%～2%，该病治愈率低且复发率高，是世界公认的疑难顽症。迄今为止，其病因及发病机理尚未阐明[18-19]。青龙衣治疗白癜风历史悠久且临床效果较好，本研究对其物质基础和作用机制进行探究，初步得到21个关键活性成分和27个关键靶点，这些关键活性成分主要为二芳基庚烷类、醌类衍生物和黄酮类化学成分。网络药理学结果显示，关键活性成分主要作用于ESR1、BCL2、PTPN22、MAOA、EGFR、ACHE等靶点，这些靶点涉及白癜风相关的多种病理因素，如遗传、神经内分泌、氧化应激、炎症、凋亡等。

白癜风患者ESR1基因内含子1C/T 等位基因与正常人有显著性差异[20]。有学者应用含有雌激素的类固醇-甲状腺激素混合物可成功治疗白癜风[21]。雌激素受体1(ESR1，Estrogen Receptor 1)是青龙衣治疗白癜风关键靶点中综合评分最高的一个靶点(Degree=17)。网络药理学结果显示青龙衣中的1-羟基-6-甲基蒽醌、1,3-二羟基蒽醌、核桃素A、核桃素C等9个化合物均可能作用于此靶点。分子对接结果进一步验证了1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羟基蒽醌、1-甲基-3,8-二羟基-6-甲氧基蒽醌对ESR1的作用活性。

乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase，ACHE)是生物神经传导中的一种关键性酶。白癜风患者表皮中存在ACHE，且活性降低，ACHE的减少导致乙酰胆碱ACh增加，ACh能抑制多巴氧化酶活性，进而抑制黑色素生成，从而加重白癜风患者表皮黑色素脱失[22]。在B16F10小鼠黑色素瘤细胞的黑色素生成过程中，也观察到ACHE水平显著降低[23]。另有学者认为，ACHE通过氧化应激途径诱导细胞色素脱失[24]。网络药理学结果显示，青龙衣中的2,3-二甲基-5-羟基-1,4-萘醌、2,3-二氢-5-羟基-1,4-萘醌、枫杨素等10个化合物均可能作用于此靶点，分子对接结果表明筛选的化合物可能与此靶点作用不强。

单胺氧化酶(Monoamine oxidase A，MAOA)是一种参与多巴胺降解的酶。多巴胺已被证明对黑素细胞有毒性，白癜风患者的多巴胺水平表达升高。研究[25]发现，在活跃期白癜风患者的皮损部位，MAOA的mRNA水平和蛋白水平均显著增加。网络药理学结果显示，青龙衣中的2,3-二甲基-5-羟基-1,4-萘醌、4-甲氧基-5-羟基-1-四氢萘酮、胡桃醌、槲皮苷、芹菜素5个化合物可能作用于此靶点。分子对接结果进一步验证了胡桃醌、2,3-二甲基-5-羟基-1,4-萘醌对MAOA的作用活性。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22型(Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)代表了自身免疫性疾病的候选基因[26]。研究[27-28]发现，PTPN22基因中的单核苷酸多态性是白癜风的易感因素，PTPN22+1858C/T等位基因在白癜风患者中出现的频率显著高于正常对照，认为是罹患白癜风的危险因素。网络药理学结果显示，青龙衣中的胡桃醌、2,3-二氢-5-羟基-1,4-萘醌、对苯二酚等可能作用于此靶基因。分子对接结果进一步验证了胡桃醌、2,3-二氢-5-羟基-1,4-萘醌对PTPN22的作用活性。

研究表明，白癜风皮损黑素细胞减少或消失的机制之一可能为细胞凋亡[29]，有实验发现，白癜风非白斑区黑素细胞凋亡增加的同时，抗凋亡因子BCL2的转录和翻译水平也随之上调，可能为代偿性保护性调节反应[30]。网络药理学结果显示，青龙衣中的1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羟基蒽醌、大黄素可能作用于BCL2靶点，分子对接结果进一步验证了1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌和1,3-二羟基蒽醌对BCL2的作用活性。

综上，白癫风发病机制复杂，青龙衣治疗白癫风疗效确切，但其作用机制和物质基础不明确，限制了其应用，本研究基于网络药理学研究方法，对青龙衣治疗白癜风多成分、多靶点作用方式进行了系统研究，借助分子对接技术进行验证，初步预测了其药效物质基础与作用靶点。青龙衣中主要特征成分醌类成分胡桃醌、1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌、1,3-二羟基蒽醌、1-甲基-3,8-二羟基-6-甲氧基蒽醌、2,3-二甲基-5-羟基-1,4-萘醌、2,3-二氢-5-羟基-1,4-萘醌是青龙衣治疗白癫风的物质基础，其作用靶点可能为ESR1、MAOA，PTPN22，BCL2，其作用机制可能是增加雌激素释放，降低多巴胺水平，抑制蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22型，抑制细胞凋亡。该研究可为青龙衣治疗白癜风的后续研究，以及开发治疗白癜风的药物提供依据。