铜离子对大菱鲆幼鱼的急性毒性

师皓晨 万玉美 孙桂清 赵海涛 崔兆进 吴彦 陈秀玲

摘 要：在水温（15±2）℃条件下采用静水生物测试法，研究Cu2+胁迫对体重（8.19±1.47）g，体长（6.0±04）cm的大菱鲆（Scophthalmus maximus）幼鱼的急性毒性。研究结果表明：随水中Cu2+浓度的升高，大菱鲆幼鱼表现出更多显著的急躁狂游、抬头频繁、跳跃、鳃盖起伏剧烈和分泌黏液等应激行为，随胁迫时间增加，大菱鲆幼鱼的死亡率显著升高。Cu2+对大菱鲆幼鱼的48 h、72 h和96 h半数致死浓度（LC50）分别为2926、1.733和1.221 mg/L。安全质量浓度（SC）为0.122 1 mg/L。暴露时间为48 h、72 h和96 h回归方程分别为y=2.065 x+4.037 1，y= 4.095 3 x+4.022 3和y= 8.745 9 x+4.243。Cu2+对大菱鲆幼鱼属于中等毒性物质。

关键词：大菱鲆;急性毒性;Cu2+;LC50;SC

我国大菱鲆（Scophthalmus maximus）工厂化养殖规模居全球之首[1]，主要养殖地区集中在渤海湾的三省一市，即河北省、山东省、辽宁省和天津市，而渤海湾是目前我国收纳污染物最多的海域，且渤海湾海水中的重金属含量超出平均水平24倍[2]。王宏伟等[3]报道在天津渤海湾4种重金属的分布及生态风险评价中，Cu2+污染显著增加，表明测试区域的水体中具有潜在危害，可能对当地敏感物种产生影响。

目前，Cu2+对水生生物的胁迫作用研究在虾、蟹、鱼类等已取得一定的成果，如克氏原螯虾（Procambarus clarkii）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）、中华鲟（Acipenser sinensis）等，研究主要涵盖急性毒性、行为、生理生化和分子水平等方向。关于鱼类暴露于Cu2+的研究主要有Cu2+胁迫下鱼类的急性毒性和行为方面。宋波澜等[4]研究表明随水体中Cu2+浓度升高中华鲟幼鱼在水中表现出明显的中毒症状，如出现呼吸频率降低、摆尾次数增加等异常生理现象。秦华伟等[5]研究表明，受到Cu2+胁迫的褐牙鲆（Paralichtys olivaceus）出现焦躁不安、狂游、跳跃、鳃盖起伏剧烈、体表分泌大量黏液和痉挛等异常生物行为现象。

然而，目前尚没有关于海水养殖过程中Cu2+胁迫对大菱鲆幼鱼急性毒性的研究，为此，本试验以大菱鲆幼鱼为试验對象，研究Cu2+胁迫下大菱鲆幼鱼的中毒症状和急性毒性效应，并获得Cu2+对大菱鲆幼鱼的半数致死浓度（LC50）和安全浓度，为大菱鲆的工厂化养殖及水质的评判和检测提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验用的大菱鲆幼鱼购于河北省半滑舌鳎良种场，体重（8.19±1.47）g，体长（6.0±0.4）cm。挑选大小均等、体表无伤痕、体质健康强壮的幼鱼进行试验研究。试验前进行7天暂养，暂养期间水温（15±2）℃。持续24 h通气，每天换水两次并及时清除池内的粪便及残饵。日投饲量为试验鱼体重的1.78%，分两次投喂。在试验开始的前一天停止喂食。

1.2 试验方法

急性毒性试验采用静水试验的生物测试法，在试验期间不对试验液进行更换。试验于养殖车间的聚乙烯塑料水族箱中进行，光照周期为自然光，保证每个水族箱所处环境相同。试验用沙滤池过滤海水，水温为（15±2）℃，24 h充氧，保证试验水体溶氧含量正常。

1.2.1 急性毒性预试验 通过预试验对药液质量浓度的大致范围进行确定，预试验水体量以鱼的负荷1 g鱼/L水计算[6]，共使用82 L水。预试验浓度梯度设置4组，分别为0.1、1.0、10.0、1000 mg/L，每组设置3个平行。按照浓度从低到高的顺序将大菱鲆幼鱼移入已配置好的浓度组中[7]，每个浓度组放入10尾大菱鲆幼鱼。试验中连续观察96 h，并于每6 h检查并且准确记录大菱鲆幼鱼的死亡情况。在幼鱼中毒后，使用玻璃棒轻触幼鱼尾部，如无反应则判断为死亡并将死鱼及时清出[6]。

第一次预试验结束后，根据大菱鲆幼鱼的死亡情况设置第二次预试验，缩小正试验的浓度范围。设置5组浓度梯度，分别为0.5、1.0、2.0、40、8.0 mg/L。每个浓度组放入10尾大菱鲆幼鱼，并设置3个平行。连续观察96 h，每隔6 h检查大菱鲆幼鱼死亡情况，准确统计并计算大菱鲆幼鱼在不同浓度梯度下的死亡概率。

1.2.2 急性毒性正试验 正式试验的浓度梯度根据预试验结果按等对数等比级数设置6个质量浓度，分别为1.00、1.26、1.58、2.00、2.51、3.16 mg/L组和对照组0 mg/L，每组15尾大菱鲆幼鱼，并设置3个平行。每6 h检查鱼的生存情况，捞出死鱼准确统计数据，并在试验过程中观察存活大菱鲆幼鱼的行为和中毒症状。在将死鱼捞出后观察其中毒死亡的症状，并对死鱼进行解剖，观察其内脏及鳃在Cu2+胁迫后发生的变化。全部试验过程中不换水、不投饲，在发现水族箱底部有粪便沉淀时使用抄网捞起。

1.2.3 半数致死浓度（LC50）和安全质量浓度（SC） 利用概率单位图解法求Cu2+胁迫对大菱鲆幼鱼的半数致死浓度（LC50）。将大菱鲆幼鱼死亡率转化为死亡率的概率单位作为纵坐标，Cu2+的质量浓度转化为浓度对数作为横坐标，并由计算得到其回归方程和R2值。将48 h、72 h和96 h死亡率为50%，即其概率单位等于5作为y值代入回归方程，即可求出48 h、72 h和96 h的LC50。

计算LC50的95%置信区间公式：

lgLC5095%的置信区间=lgLC50±1.96×2S2N

式中：S为标准差，N为概率单位在4和6范围之内的各组试验生物的总数。得出lgLC50后求其反对数，就可得到LC50的95%置信区间[7]。

安全质量浓度的计算公式[8]为：

SC=96 h LC50×0.1

2 结果与分析

2.1 Cu2+胁迫下大菱鲆幼鱼的症状及行为

大菱鲆幼鱼在不同浓度处理组中表现出不同的中毒行为，见表1。在低浓度处理组中大菱鲆幼鱼受到刺激后的活动情况与对照组基本相似，会迅速抬头在水族箱内游动，遇到水族箱壁后灵活转弯，并在游动过后平稳沉入水族箱底部，有体表黏液分布增多现象。随着胁迫时间增加，大菱鲆幼鱼在受刺激后会出现急躁狂游的中毒症状。高浓度处理组的大菱鲆幼鱼受刺激后大多表现出上升到水面沿池壁迅速转圈急躁狂游、上下抬头、跳跃、鳃盖起伏剧烈、遇水族箱壁未能灵活转弯或直接碰壁，幼鱼体表和鳃都分泌出大量黏液，暴露时间增长后鱼体表开始出现体表充血的现象。

随着暴露时间的增长，高浓度处理组的大菱鲆幼鱼活动能力开始减弱，受刺激时反应迟钝，多次刺激后才出现反应。部分幼鱼腹部朝上，体表深色斑纹褪色并出现白色块状色斑，鳃盖翘起，口大幅张开，部分鱼腹部出现充血，身体僵硬死亡。幼鱼中毒死亡个体鳃出现肿胀并伴有颜色加深的现象，部分幼鱼鳃丝上附着蓝色絮状物。部分大菱鲆幼鱼体表和鳃盖上出现了浅绿色的沉淀。Cu2+中毒的大菱鲆幼鱼在解剖后，发现其肝脏较对照组幼鱼肿大，胆囊肿大并充满胆汁，部分鱼在解剖时出现肠胀气，并在试验过程中的水体中出现白便现象。

2.2 Cu2+胁迫下大菱鲆幼魚死亡率

不同浓度的Cu2+在不同暴露时间的死亡率情况见表2。在相同的Cu2+浓度组中，大菱鲆幼鱼的死亡率随暴露时间的增长而增长。在不同浓度组中，相同时间观测点大菱鲆幼鱼死亡率随Cu2+浓度升高而升高。在48 h时，质量浓度为0、1.00、1.26  mg/L的处理组中，大菱鲆幼鱼的死亡率为0;质量浓度为1.58、2.51、3.16 mg/L的处理组中，大菱鲆幼鱼开始出现死亡。在96 h时，质量浓度为2.51 mg/L和3.16 mg/L的处理组中，大菱鲆幼鱼全部死亡。0 mg/L浓度组中，大菱鲆幼鱼未出现死亡。

2.3 Cu2+胁迫对大菱鲆幼鱼的LC50和SC

Cu2+胁迫48 h、72 h和96 h，大菱鲆幼鱼死亡率的概率单位与浓度对数呈明显的线性关系，其线性回归方程分别为y=2.065 x+4037 1，y= 4.095 3 x+4.022 3和y= 8.745 9 x+4243，相关系数R2分别为0.969 9、0.920 9和0.987 2，均大于0.9，说明数据有效性强。伴随Cu2+浓度对数增加，48 h、72 h和96 h，大菱鲆幼鱼死亡概率平稳上升。

Cu2+胁迫下，大菱鲆幼鱼48 h、72 h和96 h的半数致死浓度（LC50）和安全质量浓度（SC）见表3。研究表明，大菱鲆幼鱼的48 h、72 h和96 h的 LC50分别是2.926、1.733和1.221 mg/L;95%置信区间分别为2.134～4.011、1503～1998 mg/L和1133～1.315 mg/L。体重（8.19±1.47）g，体长（6.0±0.4）cm的大菱鲆幼鱼养殖水体中Cu2+的安全质量浓度（SC）为0.122 1 mg/L。

3 讨论

3.1 Cu2+对大菱鲆幼鱼的急性毒性和毒性分级

在对重金属离子污染安全进行评价的过程中，污染重金属的毒性和对于鱼类行为的影响十分重要。但由于不同物种对于Cu2+的耐受能力不同，会造成不同物种对Cu2+的敏感性存在很大差异[9]。如Cu2+对澳洲龙纹斑（Maccullochella Peelii peelii）幼鱼的SC为0.122 3 mg/L[10]。Cu2+对褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼鱼的SC为0.097 5 mg/L[11]。中华鲟（Acipenser sinensis Gray）幼鱼的SC为0.002 mg/L[12]。在本研究中，Cu2+对大菱鲆幼鱼SC为0.122 1 mg/L。所以各种经济鱼类对于Cu2+胁迫的敏感存在很大差异。大菱鲆幼鱼的SC远远高于中国渔业水质标准中所要求的Cu2+最高容许质量浓度（0.01 mg/L）。所以相比于大多数的经济鱼类，大菱鲆幼鱼对Cu2+胁迫的耐受性较强。

在试验过程中相同观测时间点时，随水体中Cu2+浓度的升高，大菱鲆幼鱼死亡率明显升高。根据相关资料报道，养殖水体中Cu2+的毒性受温度、水体pH值和硬度等因素的影响比较大[13]，与淡水鱼类相比，海水鱼类对于Cu2+的耐受性和安全质量浓度都比淡水鱼高，造成这种现象的原因可能是海水中含有悬浮物、有机物、镁离子、钙离子等可以降低Cu2+毒性的物质，使Cu2+对大菱鲆幼鱼的安全质量浓度得到提高。

3.2 Cu2+对大菱鲆幼鱼行为的影响及症状分析

大菱鲆幼鱼在含有Cu2+的水体中都出现了体表黏液增加，但随着Cu2+浓度的升高，幼鱼开始出现急躁狂游、抬头频繁、跳跃、鳃盖起伏剧烈、幼鱼体表和鳃分泌出大量黏液的现象。在对死鱼进行解剖后发现，鱼鳃出现肿胀并伴有颜色加深，肝脏较对照组幼鱼肝脏明显肿大。

鳃作为硬骨鱼类呼吸和进行气体交换的场所，对水体中的重金属离子反应敏感。根据相关报道，Cu2+对鳃的毒性分为两点：一是Cu2+会阻塞硬骨鱼鳃丝与水体的接触，使鱼类的呼吸和气体交换受到抑制;二是Cu2+会诱导硬骨鱼鳃发生淋巴病变，并导致鳃的呼吸机能受到破坏[13]。而鱼鳃在受水体重金属离子胁迫后产生的病变则会对硬骨鱼类的呼吸系统及循环系统产生影响，严重时则会威胁鱼类生存[14]。鱼类的肝脏具有分解循环系统中有毒物质的作用。有研究表明，重金属Cu2+的中毒机理是：因为鱼类体内的Cu2+浓度超过了其生态阈值，使鱼类肝脏内抗氧化酶的活力降低，溶酶体膜磷脂发生氧化反应，导致溶酶体膜发生破裂，释放了大量溶酶体内的水解酶，肝脏溶解性坏死，最终导致鱼类死亡[15]。

4 结论

研究表明，大菱鲆幼鱼Cu2+的96 h的半数致死浓度为1.221 mg/L，其Cu2+安全质量浓度为0.122 1 mg/L，Cu2+对于大菱鲆幼鱼的毒性应属于中等毒性物质。

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Acute toxicity of copper ion on juvenile Scophthalmus maximus

SHI Haochen1， WAN Yumei1， SUN Guiqing2， ZHAO Haitao2， CUI Zhaojin2， WU Yan2， CHEN Xiuling3

（1. Ocean College of Hebei Agricultural University， Qinhuangdao 066000， China;2. Hebei Marine and Aquatic Science Research Institute， Qinhuangdao 066000， China;3. Administration of Ocean and Fisheries of Beidaihe New Area， Qinhuangdao， Qinhuangdao 066000， China）

Abstract：The acute toxicity of Cu2+ on juvenile Scophthalmus Maximus with body weight of （8.19±1.47） g and body length of （6.0±0.4） cm was studied by hydrostatic biological test at the water temperature （15±2）℃. The results showed that juvenile turbot exhibited more significant stress behaviors such as restless swimming， frequent head raising， jumping， severe fluctuation of gill lid and mucus secretion with the increase of Cu2+ concentration. The mortality of juvenile turbot increased significantly with the increase of stress time. The median lethal concentrations （LC50） of Cu2+ to juvenile turbot were 2.926， 1.733 and 1.221 mg/L at 48 h， 72 h and 96 h， respectively. Safety mass concentration （SC） was 0.122 1 mg/L. The regression equations of exposure time for 48 h， 72 h and 96 h were y=2.065 x+4.037 1，y= 4.095 3 x+4.022 3 and y= 8.745 9 x+4.243， respectively. Cu2+ belongs to middle level toxicity substance to juvenile turbot.

Key words：Scophthalmus maximus;toxicity;Cu2+;LC50;SC

（收稿日期：2021-10-27）

基金項目：国家现代农业产业技术体系资助 （CARS-47-Z02）;河北省现代农业产业技术体系特色海产品创新团队海水鱼岗专项经费资助;农业高质量发展关键共性技术攻关专项（20326701D）。

作者简介：师皓晨（1996-），男，本科，研究方向：海水养殖技术。E-mail：2771736573@qq.com。

通信作者：赵海涛（1982-），男，高级工程师，研究方向：海水养殖技术。E-mail：ninan-tao@163.com。