牛呼吸道病毒多重PCR检测方法的建立及应用

魏硕佟，谢 婧，熊新雪，马佳睿，李瑞乾，缪西鹏，许立华

(宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

牛呼吸道综合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)是一种多因素传染病，在奶牛与肉牛中都较为常见。其特征是具有复杂的感染病原学[1-2]，严重影响奶牛及肉牛的生产性能，也严重危害了养牛行业的健康发展。病毒感染是引起呼吸道疾病的重要因素，主要病原包括牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛副流感病毒 3 型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV-3)等。在病原体感染、环境、运输等相关因素的相互作用下[3-4]，BRDC极易给养殖业造成巨大的经济损失，因此，加强对其病原的快速检测具有重大意义。

BVDV为黄病毒科、瘟病毒属的有囊膜单股RNA病毒。BVDV在全球范围均有检出[5]，在中国检出率可达53%[6]。IBRV为泛嗜性病毒，属于疱疹病毒科的有囊膜DNA病毒，可引起多种疾病，包括呼吸道疾病、生殖疾病、晚期流产以及牛的神经和全身疾病等，国内综合检出率约为40%[7]。BRSV属于副黏病毒科、肺病毒属，是有囊膜的单股负链RNA。BRSV在世界上广泛分布，包括美国、意大利、伊朗、巴西、厄瓜多尔等国家均有流行[8-12]。BCoV为冠状病毒科、冠状病毒属有囊膜的单股正链RNA病毒，大小为80～160 nm，是最大的RNA病毒之一，易造成成年奶牛冬季痢疾和犊牛呼吸道及胃肠道疾病[13]。BPIV3是不分节段的单股负链RNA病毒，有囊膜，属于副黏病毒科、呼吸道病毒属，可感染人、牛、水牛、羊等多种哺乳动物[14]。

多重PCR检测方法相较于传统检测方法具有可同时检测多种病原、操作简便、灵敏度高及经济便捷等优点。本试验建立检测牛呼吸道病毒包括BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3的多重PCR方法，并在宁夏地区规模化养殖场采集鼻拭子样品进行检测，以期为牛呼吸道病毒病的检测、流行病学调查及综合防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3、BRoV、M.bovis、S.aureus阳性样品均由本实验室鉴定保存。2019年9月至2020年11月，自宁夏地区各规模化牛场采集疑似病牛的186份鼻拭子样品。

1.2 主要试剂和仪器设备病毒DNA/RNA提取试剂盒SE Viral DNA/RNA Kit、胶回收试剂盒Gel Extraction Kit和质粒小提试剂盒Plasmid Mini Kit均为OMEGA公司产品；PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit为TaKaRa公司产品；Taq DNA Polymerase、pEASY-Blunt Simple载体、Trans1-T1感受态均为全式金公司产品；DL1200 DNA Marker为天根公司产品；PCR仪为BIO-RAD公司产品。

1.3 引物设计利用Primer Premier 5.0软件， 根据NCBI中已公布的BVDV的5′UTR、IBRV的gB基因、BRSV的N基因、BCoV的N基因、BPIV3的HN基因保守区域分别设计引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息和目的片段预计扩增大小见表1。

表1 引物信息和目的片段预计扩增大小

1.4 核酸提取所有阳性样品和待检样品参照提取试剂盒提取病毒DNA/RNA，-20℃保存病毒DNA，-80℃保存病毒RNA。参照反转录试剂盒将病毒RNA进行反转录，获得cDNA后于-20℃保存。

1.5 重组质粒标准品的制备将获得的病毒DNA和cDNA作为模板，利用设计好的引物进行PCR扩增。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。参照胶回收试剂盒回收并纯化PCR产物，分别与pEASY-Blunt Simple载体连接，转化至Trans1-T1感受态，最终获得重组质粒并测序鉴定。将测序结果正确的重组质粒分别命名为pEASY-BVDV、pEASY-IBRV、pEASY-BRSV、pEASY-BCoV、pEASY-BPIV3，并测定质粒浓度，计算拷贝量。

1.6 多重PCR反应条件的优化对退火温度(53～65℃)、引物浓度(0.05 ～0.4 μmol/L)、Mg2+浓度(2 ～5 mmol/L)、酶浓度(1～3 U)等反应条件进行优化。

1.7 特异性试验用优化后的多重PCR检测方法对BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3、BRoV、M.bovis和S.aureus进行检测，并用ddH2O作为阴性对照，以验证检测方法的特异性。

1.8 敏感性试验将5种阳性重组质粒分别按梯度稀释(101～109拷贝/μL)，并作为模板，以检测多重PCR方法的最低检测限。

1.9 重复性试验用优化后的多重PCR检测方法对阳性重组质粒进行重复性试验。

1.10 多重PCR检测方法的应用利用所建立的多重PCR检测方法对实验室采集的186份鼻拭子样品进行检测，并与单重PCR检测方法进行对照。

2 结果

2.1 多重PCR最佳退火温度的确定建立50 μL反应体系：Taq酶 1 μL，10×buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，模板各0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O补足50 μL。反应条件：94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 45 s,72℃ 90 s,30个循环;72℃ 5 min。其中退火温度设定为53,53.8,55.4,57.7,60.6,63,64.3,65℃。结果显示，各退火温度均能扩增出目的条带(图1)。最终根据设计引物的T值，选取最佳退火温度为53.8℃。

M.DL1200 DNA Marker；1～8.分别为退火温度由53～65℃每2℃依次递增的PCR产物图1 退火温度优化

2.2 多重PCR最佳引物浓度的确定将体系中各引物浓度由0.05 ～0.4 μmol/L每0.05 μmol/L依次递增，退火温度设定为53.8℃，其他条件不变，选取条带中最清晰且各引物用量最少的浓度，最终确定最佳引物浓度为0.2 μmol/L(图2)。

M.DL1200 DNA Marker；1～8.分别为引物终浓度由0.05～0.4 μmol/L每0.05 μmol/L依次递增的PCR产物图2 引物浓度优化

2.3 多重PCR最佳Mg2+浓度的确定将体系中Mg2+浓度由2～5 mmol/L每0.5 mmol/L依次递增，退火温度设定为53.8℃，引物用量为0.2 μmol/L，其他条件不变，选取条带中最清晰且Mg2+用量最少的浓度，最终确定最佳Mg2+浓度为2 mmol/L(图3)。

M.DL1200 DNA Marker；1～7.分别为Mg2+浓度由2～5 mmol/L每0.5 mmol/L依次递增的PCR产物图3 Mg2+浓度优化

2.4 多重PCR最佳酶浓度的确定将体系中酶浓度由1～3 U每0.25U依次递增，退火温度设定为53.8℃，引物用量为0.2 μmol/L，Mg2+浓度为2 mmol/L，其他条件不变，选取条带中最清晰且酶用量最少的浓度，最终确定最佳酶浓度为2.25U(图4)。

M.DL1200 DNA Marker；1～9.分别为酶浓度由1～3 U每0.25U依次递增的PCR产物图4 酶浓度优化

通过对退火温度、引物浓度、Mg2+浓度及酶浓度等条件的优化，最终确定最佳反应体系为：Taq酶 0.75 μL(终浓度为2.25 U)，10×buffer 5 μL(Mg2+终浓度)，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，模板各0.5 μL，上、下游引物各1 μL(终浓度为0.2 μmol/L)，ddH2O补足50 μL。最佳反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，30个循环；72℃ 5 min。

2.5 特异性试验用优化后的多重PCR检测方法检测不同阳性样品。结果显示，仅BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3能扩增出特异性条带且与目标大小一致，其他病毒或细菌均未扩增出条带，表明该方法具有良好的特异性(图5)。

M.DL1200 DNA Marker；1～9.分别为BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3、BRoV、M.bovis、S.aureus的PCR产物；10.阴性对照图5 特异性试验

2.6 敏感性试验将重组质粒pEASY-BVDV、pEASY-IBRV、pEASY-BRSV、pEASY-BCoV、pEASY-BPIV3分别梯度稀释至101～109拷贝/μL，并作为多重PCR模板。结果显示，多重PCR方法对BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3的最低检测限分别为103,103,104,103,104拷贝/μL(图6)。

M.DL1200 DNA Marker；1～9.分别为模板浓度101 ～109 拷贝/μL的PCR产物；10.阴性对照图6 敏感性试验

2.7 重复性试验用建立的多重PCR检测方法对重组质粒模板进行检测，3次检测结果一致(图7)。表明该方法具有良好的重复性。

A～C.PCR扩增结果；M.DL1200 DNA Marker；1～6.分别为多重、BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3、BRoV的PCR产物；7.阴性对照图7 重复性试验

2.8 应用性试验用建立的多重PCR检测方法对186份鼻拭子样品进行检测，并与单重PCR检测结果进行对照，其中多重PCR检测结果表明，BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3阳性检出率分别为8.06%(15/186)、10.75%(20/186)、15.05%(28/186)、16.67%(31/186)、7.53%(14/186)，并检出感染2种病原的样品4份(检出率为2.15%)，感染3种病原的样品3份(检出率为1.61%)，感染4种病原的样品6份(检出率为3.23%)，感染5种病原的样品4份(检出率为2.15%)，与单重PCR检测结果符合率为100%(表2)，证明该方法能准确诊断牛呼吸道病毒混合感染。

表2 临床样品检测结果

3 讨论

BRDC病因复杂，与病原体感染、环境及饲养管理[15]等因素相互作用有关，因此，快速准确的诊断是防控BRDC的关键。多重检测方法相较于传统检测方法具有能同时检测多种病原、快速简便等优点，尤其适用于BRDC这类由于多种病原引起的疾病。国内外学者也建立了许多相关检测方法。PANSRI等[16]建立了一种多重qPCR试剂盒，可对5种引起牛呼吸道疾病的病毒同时进行检测和定量，可作为一种检测和定量相关病原体的新工具。THANTHRIGE-DON等[17]将基因芯片和多重PCR反应结合，建立了一种多重PCR-电子微阵列分析方法，能够检测和区分BRDC相关的4种细菌(溶血曼海姆菌、组织希氏菌、多杀性巴氏杆菌和牛支原体)和5种病毒(BVDV、IBRV、BRSV、BPIV3和BCoV)，是单一样品中检测和区分多种病原体的有力工具。

本试验建立的多重PCR检测方法对BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3的最低检测限分别为103，103，104，103，104拷贝/μL，具有良好的敏感性。该方法能从临床样品中检测出5种病毒，与单重PCR检测结果一直，表明该方法可用于临床中的诊断。同时，对于2～5种病原混合感染检出率分别为2.15%，1.61%，3.23%，2.15%，表明宁夏地区牛群中存在多种病原混合感染情况。

本试验通过优化退火温度、引物浓度、Mg2+浓度、酶浓度等反应条件，建立了一种同时检测BVDV、IBRV、BRSV、BCoV、BPIV3 这5种牛呼吸道病毒的多重PCR检测方法。该方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，可以成功从采集的疑似感染牛鼻拭子中检测到5种病原，为牛呼吸道病毒的单一诊断及混合感染诊断提供技术支持，也为相关流行病学研究提供参考。