HPLC-DAD法同时测定滋阴清热降糖丸中9种成分

2021-12-23郭华荣顾崇梅

中成药 2021年12期

郭华荣，顾崇梅

(酒泉市药品检验检测中心，甘肃酒泉 735000)

滋阴清热降糖丸由沙参、麦冬、地黄等8味药材组成，是由《景岳全书》所载玉女煎结合糖尿病特点和多年临床应用经验组方而成，适用于阴虚热盛型消渴病(Ⅱ型糖尿病)，方中以北沙参、麦冬为君，养阴生津止渴；以地黄、知母、黄连、大黄为臣，清热凉血，滋阴降火；佐以苍术、僵蚕，燥湿化痰，诸药合用，共奏滋阴清热之功，现代药理研究证实，麦冬、地黄、知母、黄连、大黄有明显降糖作用[1-5]，印证了本方功效。该制剂于2004年申请取得质量标准批准文号(甘药制字Z04090939)，但其检验项目仅为显微鉴别和梓醇TLC鉴别，未对处方中主要成分进行定量分析，近年来也未对质量标准作进一步研究。

因此，本实验采用HPLC-DAD法同时测定滋阴清热降糖丸中大黄所含大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚[6]，麦冬所含鲁斯可皂苷元[7]，知母所含芒果苷[8]，地黄所含毛蕊花糖苷[9]，苍术所含苍术素[10]的含量，为该制剂质量标准完善提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(配置DAD检测器)购自美国安捷伦公司；XPE205DR电子天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DK-98-11A恒温水浴锅购自天津秦斯特仪器有限公司。

1.2 试剂与药物芦荟大黄素(批号110795-201710，纯度98.3%)、大黄酸(批号110757-201607，纯度99.3%)、大黄素(批号110756-201913，纯度96.0%)、大黄酚(批号110796-201922，纯度99.4%)、大黄素甲醚(批号110758-201817)、毛蕊花糖苷(批号111530-201713)、苍术素(批号111924-201806，纯度99.5%)、鲁斯可皂苷元(批号111909-201906，纯度98.0%)、芒果苷(批号111607-201704，纯度98.1%)对照品均购自中国食品药品检定研究院。滋阴清热降糖丸源于酒泉市中医院(批号20190603、20190911、20191205、20200509、20200806、20201225)，相关阴性样品为自制。分析纯磷酸购自天津市化学试剂厂；分析纯甲醇购自国药集团化学试剂有限公司；色谱纯甲醇、乙腈购自德国默克公司；水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 InertSustain C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相乙腈(A)-甲醇(B)-0.1%磷酸(C)，梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；DAD检测器，检测波长0～12 min 280 nm(芒果苷)，12～17 min 340 nm(毛蕊花糖苷)，17～35 min 280 nm(鲁斯可皂苷元)，35～71 min 254 nm(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)，71～95 min 340 nm(苍术素)；进样量20 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取芒果苷、毛蕊花糖苷、鲁斯可皂苷元、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、苍术素对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为452.4、1 103.8、464.4、490.5、412.8、1 060.4、391.5、484.6、1 002.1 μg/mL的贮备液，精密量取适量，再分别进一步稀释至45.24、110.38、46.44、49.05、41.28、106.04、39.15、48.46、100.21 μg/mL，即得。

2.2.2 供试品溶液取丸剂适量研细，精密称取细粉10 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入100 mL甲醇，称定质量，浸泡30 min后回流提取1 h，冷却至室温后甲醇补足减失的质量，摇匀，取续滤液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液取缺麦冬、缺地黄、缺大黄、缺知母、缺苍术的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验取对照品、供试品、阴性样品溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品在与对照品相同保留时间处有色谱峰，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

1.芒果苷 2.毛蕊花糖苷 3.鲁斯可皂苷元 4.芦荟大黄素 5.大黄酸 6.大黄素 7.大黄酚 8.大黄素甲醚 9.苍术素1.mangiferin 2.verbascoside 3.ruscogenin 4.aloeemodin 5.rhein 6.emodin 7.chrysophanic 8.physcion 9.atractylodin图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察精密量取对照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，甲醇稀释至20 mL量瓶中，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，其质量浓度为横坐标(X)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度试验取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得芒果苷、毛蕊花糖苷、鲁斯可皂苷元、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、苍术素峰面积RSD分别为1.89%、2.35%、1.77%、2.49%、2.78%、2.51%、2.23%、1.85%、1.89%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验取同一批丸剂(批号20200806)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得芒果苷、毛蕊花糖苷、鲁斯可皂苷元、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、苍术素峰面积RSD分别为1.54%、2.09%、1.87%、2.38%、2.64%、2.33%、2.47%、2.01%、1.80%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验精密量取“2.2.2”项下供试品溶液20 μL，于0、2、4、8、16、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得芒果苷、毛蕊花糖苷、鲁斯可皂苷元、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、苍术素峰面积RSD分别为1.95%、2.36%、1.81%、2.19%、2.72%、2.44%、2.30%、1.75%、1.41%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验精密称取同一批丸剂(批号20200806)6份，每份5 g，精密加入对照品溶液(芒果苷、毛蕊花糖苷、鲁斯可皂苷元、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、苍术素质量浓度分别为3.753 0、0.150 5、1.507 8、0.068 0、0.103 0、0.124 0、0.151 0、0.070 0、2.310 0 mg/mL)1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，9种成分平均加样回收率(RSD)分别为芒果苷96.74%(1.81%)、毛蕊花糖苷100.91%(2.23%)、鲁斯可皂苷元98.85%(1.65%)、芦荟大黄素97.13%(2.40%)、大黄酸96.42%(2.80%)、大黄素100.34%(2.18%)、大黄酚97.20%(2.51%)、大黄素甲醚(2.48%)、苍术素95.86(2.08%)。

2.4 样品含量测定取6批丸剂(批号20190603、20190911、20191205、20200509、20200806、20201225)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果 (mg/g)Tab.3 Results of content determination of various constituents (mg/g)

3 讨论

3.1 检测波长筛选本实验采用DAD检测器对供试品溶液进行190～400 nm全波长扫描，发现芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚在254 nm处吸收良好，色谱峰对称性理想；鲁斯可皂苷元、芒果苷在280 nm处有最大吸收，色谱峰响应值比较大；毛蕊花糖苷、苍术素在340 nm处有最大吸收，故选择254、280、340 nm作为检测波长。

3.2 流动相筛选本实验以乙腈-磷酸[11-12]、甲醇-磷酸[13-15]、甲醇-醋酸[16]、乙腈-醋酸为流动相进行梯度洗脱，发现均能将芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分离，但其他成分分离效果不佳。最终，选用甲醇-乙腈-0.1%磷酸[17]，能将9种成分全部分离，而且效果较理想。

3.3 柱温筛选本实验采用同一色谱仪和色谱柱，比较了25、30、35、40 ℃下9种成分色谱峰的分离效果，发现无明显差异。综合考虑保留时间、色谱柱耐用性、室温，最终选择柱温为30 ℃。

3.4 供试品溶液制备方法筛选本实验比较了不同提取溶剂(50%甲醇、70%甲醇、甲醇)、提取方法(超声法、加热回流法)，发现甲醇提取效果最佳，而且加热回流法较超声法提取完全。因此，选择甲醇加热回流提取作为供试品溶液制备方法。