艾柱挥发油和燃烧产物成分GC-MS分析及抗氧化活性比较

陈如一，史悦悦，张晓熙，赵鑫钰，夏道宗

(浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053)

艾叶为菊科蒿属植物艾ArtemisiaargyiLévi.et Vant.的干燥叶，为2020年版《中国药典》一部所收录的中药材。艾叶性温，味辛、苦，归肝、脾、肾经，具有温经止血、散寒止痛、理气安胎等功效[1]。艾柱是由艾叶加工的艾绒填充而成的柱状物，常用于中医药养生保健。研究表明，艾柱含挥发油、黄酮、萜类及多糖等成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等多种药理作用[2-3]。艾灸疗法是传统针灸的重要组成部分，是一种由经络调节、温热效应、燃烧产物的成分共同作用的综合效应。艾柱的燃烧产物较为复杂，文献报道其成分差异较大，除了与燃烧原材料有关外，还与燃烧装置、测定方法等有关[4]。

氧化应激是机体或细胞内氧化/抗氧化平衡失调的病理状态，在多种疾病的发生发展中起着重要作用[5]。目前有关艾叶抗氧化功能的文献报道较多[6]，但关于其加工产品艾柱的研究很少。郭太虎等[7]研究发现艾灸可使D-半乳糖所致衰老大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性升高，丙二醛(MDA)水平下降，提示艾灸具有较好的抗氧化效果。因此，本研究主要对艾柱挥发油和燃烧产物成分进行GC-MS分析，并通过自由基清除法和总抗氧化能力测定法比较其抗氧化活性，以期为深入分析艾柱及艾灸作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 7890-5977A型气相色谱-质谱仪(美国Agilent公司)；Concentrator Plus真空浓缩仪、移液枪(德国Eppendorf公司)；HA120-50-01超临界萃取装置(中国南通华安公司)；Synergy H1酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；RE52CS-1旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-Ⅲ 循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)；W201B 数控恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司)；BSA224S-CW 电子天平[赛多利斯(北京)天平有限公司]；KQ-500DE型 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药物与试剂 艾柱(浙江乾一生物科技有限公司，批号20190415)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，批号20190906)；95%乙醇(上海凌峰化学试剂有限公司，批号20181011)；抗坏血酸(广东光华化学厂有限公司，批号20190811)；2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(批号STBG8547)、2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(批号BCBT2871)、2,2-azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid diammonium salt)(批号SLBL5589V)均购于美国Sigma公司；硫酸亚铁七水合物(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号D172003)；过硫酸钾(宜兴市第二化学试剂厂，批号170501)；三氯化铁六水合物(上海泰坦科技股份有限公司，批号P1519028)；其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 艾柱挥发油提取 采用超临界二氧化碳萃取法。取艾柱150 g，置入CO2超临界萃取釜中。萃取条件为萃取釜压力21.5 MPa；温度40 ℃；萃取时间120 min；分离釜Ⅰ压力6.4 MPa，温度45 ℃；分离釜Ⅱ压力6.4 MPa，温度35 ℃。首次萃取时，每0.5 h加入50 mL无水乙醇作为夹带剂，循环萃取2次。得到的产品，离心除去蜡质沉淀，滤液于40 ℃减压回收乙醇，得到脱蜡质艾柱挥发油。以40 mg/mL的质量浓度溶于无水乙醇中，超声波振荡溶解，加入适量无水硫酸钠脱水2 h，取上清液过0.22 μm微孔滤膜后，蒸发浓缩，得到艾柱挥发油[8]。计算得艾柱挥发油的平均得率为1.46%。

1.3.2 艾柱燃烧产物收集 取50 g艾柱于自制燃烧装置的燃烧塔中，暗火燃烧，在吸收瓶中加入无水乙醇作为烟雾吸收溶剂，缓冲瓶与真空泵连接。调节循环水泵控制艾柱的燃烧速度，使燃烧产物能够被充分吸收。将艾柱燃烧产物过滤，蒸馏浓缩后，离心取上清液，计算得艾柱燃烧产物的平均得率为1.01%。

1.3.3 艾柱挥发油GC-MS分析 气相色谱条件为色谱柱Agilent HP-5MS (30 m × 250 μm，0.25 μm)；载气高纯氦气，纯度 ≥ 99.999%；进样量3 μL；体积流量1 mL/min；分流比20∶1，进样口温度300 ℃；柱温采用程序升温(100 ℃保持10 min；8 ℃/min升温至180 ℃；3 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min；1 ℃/min升温至235 ℃；10 ℃/min升温至285 ℃；最后以1 ℃/min升温至300 ℃，保持5 min)。质谱条件为EI离子源，电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；传输线温度280 ℃；四极杆温度150 ℃。全扫描模式为扫描范围m/z40～500；质谱检索标准库NIST14.L标准谱库。根据以上条件分析鉴定艾柱挥发油中的主要成分。

1.3.4 艾柱燃烧产物GC-MS分析 色谱柱、载气同“1.3.3”项；进样量1 μL；体积流量1 mL/min；分流比10∶1；进样口温度300 ℃；柱温采用程序升温(50 ℃保持10 min；4 ℃/min升温至100 ℃，保持2.5 min；4 ℃/min升温至180 ℃，保持1 min；5 ℃/min升温至230 ℃；1 ℃/min升温至235 ℃；10 ℃/min升温至285 ℃，保持5 min；最后以1 ℃/min升温至300 ℃，保持10 min)。质谱条件同“1.3.3”项。

1.3.5 抗氧化活性测定

1.3.5.1 溶液制备 取适量艾柱挥发油、燃烧产物，分别制备成质量浓度为50、100、250、500、1 000、2 500、5 000 μg/mL的样品溶液，确保艾柱挥发油及燃烧产物样品溶液在相同质量浓度下，艾柱原料的量相同。精密称取Vc适量，制备成5、10、25、50、100、250、500、1 000 μg/mL的对照品溶液，均存放于低温避光处，现用现配。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力测定 吸取100 μL 0.2 mmol/L DPPH和100 μL不同质量浓度的样品溶液于96孔板中，然后在室温(避光)下孵育30 min,用95%乙醇做参比，在517 nm处测定吸光度值Ai。测定0.2 mmol/L DPPH溶液与等体积95%乙醇的混合液的吸光度Ac，以及待测液(样品组)与等体积95%乙醇混合液的吸光度Aj[9]。重复3次，取平均值。按如下公式计算待测样品的自由基清除率，清除率=(1-(Ai-Aj)/Ac)×100%。

1.3.5.3 ABTS+自由基清除能力测定 吸取180 μL ABTS分析溶液和20 μL不同质量浓度的样品溶液于96孔板中，混匀后于暗处静置10 min，用95%乙醇做参比；在734 nm处测得吸光度值。以20 μL 95%乙醇替代样品溶液作为对照管，加180 μL ABTS分析溶液配置，测定吸光度值[9]。重复3次，取平均值。按如下公式计算待测样品的自由基清除率，清除率=(1-样品管A734/对照管A734)×100%。

1.3.5.4 总抗氧化能力测定 吸取6 μL系列浓度为400、600、800、1 000、2 000、5 000 μmol/L的FeSO4溶液，与180 μL FRAP溶液混合，再加18 μL蒸馏水，在酶标仪中37 ℃孵育4 min，于593 nm下读取吸光值，以FeSO4溶液的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。吸取6 μL待测样品，与180 μL FRAP溶液混合，再加18 μL蒸馏水，在37 ℃反应4 min，于593 nm波长下读取吸光值(重复3次，取平均值)，并在标准曲线上获得待测样品相应的FeSO4浓度，定义为当量浓度(FRAP值)。结果表示为每mg样品中相当于的FeSO4的量(mmol/L)[9]。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0以及Graphpad Prism 8.0软件进行数据分析及作图。

2 结果

2.1 艾柱挥发油中成分GC-MS分析 采用峰面积归一化法确定艾柱挥发油中各个组分的相对含量，结合相关文献以及NIST14.L标准谱库，取匹配度在80以上的最高值对成分进行归属。艾柱挥发油GC-MS总离子流图(TIC)见图1，分析结果见表1。结果显示，从艾柱挥发油中共鉴定出34种成分，主要为醇类、酚类、脂肪酸类、醛酮类、烯烃类。

图1 艾柱挥发油总离子流图

表1 艾柱挥发油成分分析结果

2.2 艾柱燃烧产物中成分GC-MS分析 艾柱燃烧产物中化学成分的分析鉴定方法同“2.1”项，其GC-MS总离子流图见图2，分析结果见表2。结果显示，从艾柱燃烧产物中也鉴定出34种成分，主要为酚类、醇类、酯类、酮类、羧酸类、烷烃类。

表2 艾柱燃烧产物成分分析结果

图2 艾柱燃烧产物总离子流图(TIC)

2.3 抗氧化活性评价

2.3.1 DPPH自由基清除作用 如图3所示，艾柱挥发油及燃烧产物均可抑制DPPH自由基的产生，其IC50值分别为1 127、85.6 μg/mL，阳性对照Vc的IC50值为4.21 μg/mL。结果表明，艾柱燃烧产物对DPPH自由基的清除能力明显强于艾柱挥发油。

图3 艾柱挥发油及燃烧产物对DPPH自由基的清除作用

2.3.2 ABTS+自由基清除作用 如图4所示，艾柱挥发油及燃烧产物均可抑制ABTS+自由基的产生，其平均IC50值分别为327.2、81.9 μg/mL，阳性对照Vc的平均IC50值为45.7 μg/mL。表明，艾柱燃烧产物对于ABTS+自由基的清除能力显著强于艾柱挥发油，与对照品Vc相当，显示出极好的抗氧化活性。

图4 艾柱挥发油及燃烧产物对ABTS+自由基的清除作用

2.3.3 总抗氧化能力测定 以FeSO4浓度为横坐标(X)，吸光度值为纵坐标(A)，进行回归，得回归方程为A=3.322 3X-1.187 9(r=0.998 7)。经过测定，艾柱挥发油的总抗氧化能力(FRAP均值)为0.278 4 mmol/L FeSO4当量，艾柱燃烧产物的FRAP均值为0.802 mmol/L FeSO4当量，对照品Vc的FRAP均值为8.003 mmol/L FeSO4当量。结果表明，艾柱燃烧产物的总抗氧化能力要显著优于艾柱挥发油，FRAP值约为后者的2.9倍。

3 讨论

艾灸疗法具有温通经脉、运行气血、回阳救逆、消毒散热、祛瘀散结等作用，其疗效的发挥与艾(柱)的药理作用、燃烧产物及其类芳香疗法作用等密切相关[10]。于密密等[11]采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用法对艾燃烧生成物中的苯酚含量进行定量测定，指出即使在极端情况下诊室内所产生的艾烟中的苯酚含量仍小于工业企业设计卫生标准(TJ36-79)规定的车间空气中有害物质最高容许浓度，证实了艾灸疗法的安全性。艾柱挥发油中含量最高的是以γ-谷甾醇(7.67%)为代表的醇类化合物，占总峰面积的19.73%，其他成分含量高低依次为酚类、脂肪酸类、醛酮类及烯烃类；其中一些化合物的生物活性已有报道，如γ-谷甾醇、α-生育酚、环氧石竹烯、龙脑、川陈皮素等具有抗氧化、抗炎抗菌、降脂、增强机体免疫力药理作用[12-14]。

此外，本研究从艾柱燃烧产物中分析鉴定出34种化合物，但这些成分与艾柱挥发油有很大差异；所鉴定成分色谱峰面积之和占总峰面积的30.73%；其中含量最高的是以苯酚(3.01%)为代表的醇(酚)类化合物，占总峰面积的14.34%，其他成分含量高低依次为酯类、酮类、羧酸类及烷烃类；艾柱燃烧产物中苯酚、豆甾醇、羽扇烯酮等成分在抗氧化、消毒杀菌、抗炎镇痛等方面具有重要作用[11,15]。

现已证明与自由基有关的疾病有上百种，进行体外实验可以排除体内实验的复杂性，从而能够更为直接地观察受试物的作用效果，为受试物的体内实验提供科学依据[16-17]。本研究通过自由基清除(DPPH、ABTS+)和总抗氧化能力(FRAP法)测定比较艾柱挥发油和艾烟燃烧产物的体外抗氧化活性，结果表明艾柱燃烧产物的抗氧化活性均明显强于艾柱挥发油。结合成分鉴定结果，α-生育酚是艾柱挥发油的重要组分，也可能是艾柱挥发油的主要抗氧化物质；此外，艾柱挥发油中具有较多的饱和及不饱和脂肪酸，但是烯烃类成分较少，这可能是其抗氧化活性弱于艾柱燃烧产物的重要原因。相反，在艾柱燃烧的过程中，产生了较多的苯酚、豆甾醇等活性物质，均具有较好的抗氧化活性。需要指出的是，本研究中所采用的体外抗氧化体系是水环境体系，在一定程度上限制了脂溶性物质抗氧化功能的发挥。另外，在以往对艾柱燃烧产物的研究中，多采用苯、正丁醇等有机溶剂进行吸收，具有一定的危害性[4,11]。本实验采用乙醇作为艾柱燃烧产物的吸收溶剂，更加贴近临床实际。

总之，本研究中艾柱挥发油和燃烧产物在成分组成上存在较大差异；在试验浓度范围内，艾柱燃烧产物的抗氧化活性明显优于艾柱挥发油，结果表明艾柱燃烧后，产生了更多活性成分，以期为深入研究艾柱药理作用机制和艾灸类芳香疗法提供依据。