烟草黑胫病菌生理小种判别及鉴别寄主的筛选

丁 昂，谷从纪，衣盛月，阮亚男，张奇瑞，夏振远，陈泽斌*

(1.昆明学院 农学与生命科学学院，云南 昆明 650214； 2.云南省烟草农业科学研究院，云南 昆明 650021)

烟草黑胫病是烤烟生产过程中的主要真菌性病害之一，且分布非常广泛[1]，其病原菌烟草寄生疫霉(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)对烟草的危害极大，会导致无法挽回的经济损失．而研究烟草黑胫病菌生理小种的判别及鉴别寄主的筛选有助于明确黑胫病原生理分化情况，进而为烟草黑胫病的防治提供理论依据．1896年，烟草黑胫病首次在印尼爪哇烟草中发现[2]；1950年，在我国黄淮烟区也发现了该病，之后蔓延至其他烟区[3-8]．随着分子生物学技术的发展及其研究的深入，愈来愈多研究者发现烟草黑胫病的致病性并不是相对稳定的．例如：Lucas[9]报道了一个弱致病力菌系，随后有研究者也陆续发现烟草黑胫病菌在致病力上存在一定的差异；1957年以来，国内外专家学者[6]开始对烟草黑胫病的生理专化性进行研究；1962年，Apple[10]把对N.plumbagitnifolia无致病力的菌系定为0号小种，高度致病力的菌系定为1号小种；其他研究者发现，烟草黑胫病菌0号小种对L8、NC1071、N.nudicaulis、N.plumbaginifolia和K326无致病力或仅有弱致病力，但对小黄金1025具有一定致病力．此外，我国生理小种的分布研究开始于20世纪80年代，0号生理小种主要分布在我国的山东省、贵州省、云南省、湖北省、河南省、陕西省、安徽省、福建省、湖南省、四川省，1号生理小种主要分布在我国的辽宁省[11]．1973年，Lamprecht等[12]采用类似方法，以Delcrest202烟草品种接种后的不同反应，在南非鉴定出2号小种；1978年，Mclntyre等[13]选用几种特定烟草品种并结合某些培养性状和生理生化特性，在美国将康涅狄格菌系0号和1号生理小种区分开来，定为3号生理小种．截至目前，烟草疫霉菌在全世界已发现的生理种有0、1、2、3号[14]．此外，李梅云[15]、李斌等[16]、苗圃等[17]主要通过TTZ颜色反应、TTC颜色反应和鉴别寄主法鉴别黑胫病菌生理小种类型．而本研究拟采用菌丝块无创伤贴接法来判别黑胫病菌生理小种类型及致病性，旨在为抗病育种、栽培和植物保护等方面控制该病害提供参考依据．

1 材料与方法

1.1 供试菌种

烟草黑胫病菌由云南省烟草农业科学研究院微生物学实验室提供，编号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分别代表菌株QJS804(分离自曲靖市师宗县五龙乡样品)、BSSDD6(分离自保山市施甸县万兴乡样品)、CXSL(分离自楚雄州双柏县大庄样品)、DLXY(分离自大理州祥云县禾甸镇样品)、CXLT(分离自楚雄州禄丰县仁兴镇样品)、YXJHD(分离自玉溪市江川区九溪镇样品)、YXHN06(分离自玉溪市红塔区高仓镇样品)、DCWS03(分离自迪庆州香格里拉市上江乡样品)、eXSBD40(分离自昭通市巧家县老店镇样品)、gh2(分离自临沧市耿马县勐永镇样品).

1.2 供试品种

鉴别寄主：L8、NC1071、Florida301、小黄金1025；对照烤烟品种：红花大金元、K326、KRK26、NC82．以上烤烟品种均由云南省烟草农业科学研究院提供．

1.3 培养基制备

称取燕麦片30 g，加入600 mL水，沸水浴上加热并不断搅拌1 h，双层纱布过滤，弃掉过滤物，滤液备用．称取琼脂粉17～20 g置于1 000 mL烧杯中，加入200 mL水，玻璃棒搅拌均匀，与滤液充分混匀，加水补足1 000 mL，趁热分装灭菌，121 ℃高压蒸气灭菌20 min.

1.4 烟苗准备

将L8、NC1071、Florida301、小黄金1025、红花大金元、K326、KRK26、NC82这8个品种放入漂浮盘进行育苗，在播种1个月时剪去叶片的1/2以上，7 d后进行第2次剪叶，剪叶7 d后移栽至温室大棚培养．

1.5 黑胫病病菌接种体制备

挑取甘油管中保存的10个菌株各1环，接种在燕麦培养基平板中间，置于28 ℃恒温培养箱培养5 d，将活化的黑胫病菌置于燕麦培养基中，每个菌株接种5皿，在28 ℃培养箱中培养7 d.

1.6 烟苗移栽

将烟苗移栽至装有栽培土的花盆中，并放置于温室大棚中，定期浇水．设置8个处理，每个处理6株，3次重复.

1.7 黑胫病菌接种

将燕麦培养基中的黑胫病菌菌丝用无菌解剖刀分割成4 mm×4 mm小块，将菌丝块贴接于烟苗的茎基部，菌丝块用脱脂棉包裹住，并向脱脂棉滴加少量蒸馏水，使其完全湿润，以保证菌丝体正常生长，并设置培养基块接种作对照[18].

1.8 病情调查

接种3 d后，以株为单位调查并记录各烟株发病情况，共调查14 d．病害严重度分级及调查方法参照国标《烟草病虫害分级及调查方法》(GB/T 23222—2008)[19]进行．

1.9 生理小种鉴别

通过分析各鉴别寄主的发病情况，计算病情指数(简称病指)，公式如下：

根据烟草品种抗病性鉴定标准[20]判断抗感性，其中：高抗或免疫(HR)，病指为0；抗病(R)，病指为0.1～20；中抗(MR)，病指为20.1～40；中感(MS)，病指为40.1～60；感病(S)，病指为60.1～80；高感(HS)，病指为80.1～100．黑胫病菌生理小种的划分参照表1．

表1 不同生理小种在鉴别寄主上的反应

2 结果与分析2.1 黑胫病菌侵染不同品种烟株的发病情况

将鉴别寄主L8、小黄金1025、Florida301、NC1071被不同黑胫病菌侵染后的致病情况列入表2．由表2可看出，鉴别寄主被黑胫病菌侵染后分别表现出不同的感病情况，其中：L8对编号为1、2、3、4、5、8、9的黑胫病菌表现为感病，对编号为6、7、10的黑胫病菌表现为抗病；小黄金1025对10个黑胫病菌全部表现为感病；Florida301除对编号为9的黑胫病菌表现为感病外，对其他9个黑胫病菌表现为抗病；NC1071对编号为1、2、3、4、5、8的黑胫病菌表现为感病，对编号为6、7、9、10的黑胫病菌表现为抗病.

表2 鉴别寄主被不同黑胫病菌侵染后的致病情况

续表2

2.2 黑胫病菌生理小种的判别

不同黑胫病菌对鉴别品种的抗感性统计列入表3．由表3可知，10个黑胫病菌鉴定为2个不同的生理小种，其中6个菌株为1号生理小种，4个菌株为0号生理小种．属于黑胫病1号生理小种的菌株有：DCWS03、CXLT、DLXY、CXSL、QJS804、BSSDD6，属于0号生理小种的有gh2、eXSBD40、YXHN06、YXJHD.

表3 不同黑胫病菌对鉴别品种的抗感性统计

2.3 黑胫病菌对不同栽培品种烟株的发病情况

栽培品种KRK26、红花大金元、NC82、K326在不同黑胫病菌侵染下的致病情况列入表4．由表4可看出，不同栽培品种被黑胫病菌侵染后分别表现出不同的感病情况，其中：KRK26对编号为1、5、6、8、9、10的黑胫病菌表现为感病，对编号为2、3、4、7的黑胫病菌表现为抗病；红花大金元对10个黑胫病菌全部表现为感病；NC82对编号为1、3、6、7、8、10的黑胫病菌表现为感病，对编号为2、4、5、9的黑胫病菌表现为抗病；K326对编号为1、2、5、8、9、10的黑胫病菌表现为感病，对编号为3、4、6、7的黑胫病菌表现为抗病.

2.4 栽培品种中黑胫病菌鉴别寄主的筛选

通过对比表2和表4栽培品种和鉴别寄主被黑胫病菌侵染后的感病情况，发现栽培品种红花大金元与鉴别寄主小黄金1025的感病情况一致，因此可将红花大金元作为感病品种用于黑胫病菌0号和1号生理小种的鉴定．

3 讨论与结论

3.1 讨论

作为判别黑胫病菌生理小种类别的鉴别寄主需要具备的条件有：鉴别能力、抗感分明、反应灵敏稳定、重复性好[21]．根据国内外鉴定黑胫病菌生理小种类型的试验来看，本试验选用的4个鉴别寄主L8、小黄金1025、Florida301、NC1071具有明显的鉴别能力，从其发病情况可以直观地判别黑胫病菌生理小种类型，满足试验需求.

表4 不同黑胫病菌在栽培品种上的致病情况

分析不同黑胫病菌侵染烟草栽培品种后的感病情况，发现KRK26对编号为6、9、10的0号生理小种和编号为1、5、8的1号生理小种均表现为感病，对编号为7的0号生理小种和编号为2、3、4的1号生理小种均表现为抗病．NC82及K326在不同黑胫病菌侵染后均呈现与KRK26一样的发病情况，因此不可将这3个栽培品种作为鉴别寄主.

通过对比表1、表2和表3可以发现，鉴别寄主L8和Florida301对编号为9的0号黑胫病菌生理小种表现为感病，该结论与黑胫病菌生理小种的划分结果(参照表1)不符．由此可见，菌丝块无创伤贴接法可能受外界条件影响，致使烟株表现出不同的感病情况．例如K326、NC82会对不同类型的生理小种表现出不同的感抗性，因此不同黑胫病菌生理小种侵染这两个抗病品种后会表现出不同的感病情况．近年来，分子生物学方法极大地帮助了生理小种的鉴定[22]．因此，有必要将分子生物学与传统方法相结合，才能对烟草黑胫病菌生理小种进行更加深入的研究.

3.2 结论

采用菌丝块无创伤贴接法对10个黑胫病菌进行生理小种判别结果表明，6个菌株属于1号生理小种，4个菌株属于0号生理小种．栽培烤烟品种KRK26、NC82、K326在被10个不同黑胫病菌侵染后均未呈现出感病症状，而栽培品种红花大金元与鉴别寄主小黄金1025的发病情况一致，因此可以将红花大金元用于黑胫病菌0号和1号生理小种的鉴定．