InVia-Reflex显微共焦拉曼光谱仪的使用与管理维护

李 雪，郑 振,2，洪光辉，徐 超，崔喜平,2，曾 岗，杨 磊

(1.哈尔滨工业大学 分析测试与计算中心，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.哈尔滨工业大学 材料科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150001)

拉曼光谱具有高灵敏的分子差异识别能力，同时具备无需制样、无需标记、非接触、无损伤、检测快速等优点，因此在材料表征分析方面占据了重要地位.单张散射拉曼光谱包含一个或多个特征峰，每个特征峰又包含峰位、峰强和峰宽等信息，可提供样品微区的化学结构[1]、成分[2-4]、晶相和形态[5-6]等信息.而由多张光谱构成的拉曼成像则可表征样品微区空间上结构、组分、物相、应力等直观分布信息.随着激光光源的引入、探测器的改进和计算机性能的提高，当前拉曼光谱在生物、材料、医学、化学、食品等领域都有很好的应用[6].此外，将拉曼与其他仪器的联用技术应用于原位检测，在大大提升检测效率的同时，也拓宽了拉曼光谱仪应用的范畴.因此，拉曼光谱仪已成为材料分析领域的常规配备.

InVia-Reflex显微共焦拉曼光谱仪是英国Renishaw公司生产的高灵敏度、高度自动化的拉曼光谱分析仪器.设备特点包括：(1) 同时配备了从紫外到近红外4个波长的激光光源，各激发波长采用分立光路设计，去除了各光源间的干扰，最大程度的提高了通光能力.(2) 切换波长时，激光光路采用计算机控制全自动切换，调节方便、快速.(3) 数据采集采用数字化共焦调节技术，极大降低光路调节难度，提高了数据采集效率.(4) 采用自动瑞利滤波片转台模块和位置可调的透镜组形式，实现多光路共存设计，具有稳定性高、重复性好、易于操作和维护等优点.

本文从设备自身特点出发，对设备使用方法、常见问题与解决方案、设备维护与管理经验进行了详细总结与分析.

1 工作原理

InVia-Reflex显微共焦拉曼光谱仪主要由激光发生器、样品光路、分光光路、光探测器、数据读取系统和电脑控制系统构成.图1为该设备光路图，激光器发射激光，进入光谱仪内部，通过反射镜进入显微镜物镜，经物镜入射到样品待测微区.入射激光与样品相互作用发生散射(包括瑞利散射和拉曼散射)，散射光再由显微物镜收集，经滤光片滤除瑞利散射后得到拉曼散射光，在经分光光路进行分光，最后聚焦到电荷耦合元件(CCD)入口处进行信号收集.最终CCD把所收集到的光信号转化为数字信号，在电脑中以光谱曲线的形式表示出来.

图1 InVia-Reflex显微共焦拉曼光谱仪光路图

2 仪器的硬件设置

InVia-Reflex显微共焦拉曼光谱仪是对InVia基础型号的配置升级产品.光源从一个激光波长增加到4个激发波长，波段覆盖了从紫外到近红外光谱范围，可选配光致发光附件、偏振附件、多功能变温样品台附件，实现更多测试功能.根据不同试验的测试需求，可选择合适的激发波长、滤波片、透镜组、光栅等光学元件.因此，需要使用者充分了解仪器的主要部件、构造及仪器自身的性能，熟练掌握各部件的正确使用.

3 仪器使用

3.1 开机与系统校准

InVia-Reflex显微共焦拉曼光谱仪的一般测试步骤如下：开机-校准-放置样品-聚焦样品-试验参数设置-测试和光谱收集-保存数据.

开机顺序：先打开光谱仪主机电源，再启动软件进行自检，待自检完成后打开激光器，激光器预热30 min后开始试验，设备不能频繁的关闭启动，相邻两次开启时间应大于1 h.

仪器的校准和调试：拉曼光谱仪的日常校准关系到样品检测的准确性，由于实验室温度、湿度等环境因素的变化，尤其是在切换不同波长的激光器，更换相应刻线密度的光栅之后，仪器的灵敏度和准确度会出现偏差，因此很有必要对光谱仪系统进行校准，对光路进行调整和优化，使仪器的性能状态达到最佳，从而得到高质量的光谱数据.

图2是使用显微共焦拉曼光谱仪内置的单晶硅片对光谱仪系统校准的结果：室温条件下单晶硅的一阶峰位为520.7 cm-1.

图2 单晶硅的一阶拉曼带(520.7 cm-1)

3.2 样品预处理

InVia-Reflex显微共焦拉曼光谱仪可分析多种不同类型的样品，包括固体样本(粉末、块体、纤维、薄膜、胶体)、液体、气体等.但纯金属样品不能使用拉曼检测分析.

3.2.1 固态样品预处理

固态样品预处理与分析区域选择：块体样品尽量选择上表面平整的区域，保证表面光洁无污染.粉体样品可以取少量粉末至于载玻片上，用另外一个载玻片压平、压实.对于不规则形态固态样品进行拉曼扫描成像时，需将样品固定在样品台上，最好物理接触，必要时利用磁条、夹具、胶带等工具进行固定.样品成像区域的表面要求水平且平整，确保在扫描成像过程中样品位置的准确性和可重复性.上表面无法调节水平时，可借助三维样品旋转台调节样品上表面平度[7].

3.2.2 液体样品预处理

无毒、无腐蚀、不易挥发的液体样品直接在凹面载玻片上滴一滴，将激光聚焦在液滴中间位置进行分析.易挥发或具有腐蚀性的液体样品可以使用专用的液体样品池进行分析，也可以将液体装在密封的玻璃容器中，将激光聚焦在液体中央，得到容器内液体高质量的拉曼光谱.相比专用的液体样品池，此方法既方便测试，又可避免污染.

3.2.3 气体样品预处理

由于气体的分子密度特别低，需要将气体样品冲入密闭容器，通过加压方式增大单位体积的气体分子密度，选用大功率的激光器，在测试时较大的激光功率参数，增大入射光的激光强度，以获得高质量的光谱数据.

3.3 试验测试参数的优化设置

选择合适的试验测试参数可以提高拉曼光谱数据采集质量和效率，常见参数设置包括：(1) 激光功率应根据不同样品相应设定，对于性质不稳定的样品、生物类样品以及拉曼信号很强的样品，应选用小功率激光激发.曝光时间通常设定10 s左右，可根据样品情况和信号表现做适应性调整.(2) 光谱采集范围应根据实际待观测样品特征峰峰位置，合理调整波数采集范围，提高采集效率.为了在短时间内得到最佳的拉曼光谱图，可以先使用静态取谱模式进行预扫描，通过预扫描情况和测试需求平衡曝光时间、信号强度和测量精度等相关参数，最终进行正式测试.

4 拉曼测试中常见问题及解决方案

4.1 光谱中的假峰

在测试中有时会出现一些位置随机的尖锐的峰(如图3所示)，这类假峰通常为宇宙射线.宇宙射线随着曝光时间的增加出现概率增大，多次测量会发现尖锐的峰会消失，宇宙射线可通过配套软件去除.如果假峰在相同位置重复出现，此时应排除宇宙射线干扰，可能是外界干扰光源问题，如显示器、荧光灯、气体激光器的等离子线等，尤其是在使用长焦镜头时更为严重.此种情况可通过关闭室内干扰光源，检查光源的等离子滤波片等步骤来避免该类假峰的出现.

图3 宇宙射线

4.2 激光损坏样品

激光功率过大可能会破坏样品的分子结构，导致样品光解、变性或热分解，造成样品不同程度的损伤，此时测得的拉曼信号主要是样品变性后的特征，而不是样品本身的特征.因此，光谱采集完成后，应在显微镜下对测量点进行仔细检查，图4为激光损坏样品的白光图.为避免激光损伤样品影响试验结果，测试时一般从小激光功率开始尝试.对于不稳定容易分解的样品，在降低激光功率的同时，通过扩束器扩束方式，增大到达样品的激光光斑尺寸，降低单位面积上激光功率密度.在获得满意光谱的前提下，应尽可能使样品上的激光功率密度最低.

图4 激光损坏样品白光图

4.3 激光强度变化引起拉曼光谱特征改变

进行显微拉曼测试时，激光聚焦到样品上的光束直径在1～2 μm范围内，功率密度的增大会使测量点温度升高.随着激光强度的变大(但还未达到损坏样品的程度)，有些样品的拉曼特征峰虽然没有增多或消失，但是特征峰的峰位、峰形和峰宽都产生了改变.产生这类现象的主要原因是：在激光照射下，待测区域温度升高，样品的成分和结构虽然没有改变，但是结构参数如原子/离子间距和键角等都发生了微小变化，导致特征峰峰位发生偏移.例如，对碳纳米管进行拉曼表征时，随着激光功率的提高，晶体温度随之升高，晶格发生膨胀，C—C键变长，相邻原子间的相互作用力常数变小，导致所有振动模拉曼峰都向低波数移动.而且，碳纳米管热导率低，激光聚焦产生的热能更容易聚集，热效应增加，峰位更容易发生偏移.激光聚焦热效应造成的拉曼峰偏移，虽然影响了拉曼的定性和定量分析，但却有助于研究材料结构变化特性，已有课题组对此进行了专门研究，主要包括低维纳米半导体材料如碳纳米管[8]、量子点ZnO[9]、Si纳米线[10]、氮化镓纳米棒[11]等.消除激光强度变化引起的拉曼光谱特征改变影响，可以从两方面着手：一是使用低功率激光器进行激发，二是使用恒温设备(如InVia-Reflex自带的变温样品台就具有恒温功能).

4.4 拉曼信号隐藏在强背底信号中

有些发荧光或磷光的样品在拉曼测试时会产生很高的荧光背底，这是样品的结构特性将激发光转化为荧光的缘故[12]，我们可以采取切换激光波长、光漂白、荧光猝灭、使用共焦模式等措施弱化荧光干扰.

4.4.1 改变激光波长

荧光具有固定的波长范围，拉曼散射光的波长随着激发光的波长的不同而有所变化，因此对有荧光效应的样品，可以选用紫外或近红外光源激发来避开荧光干扰.图5为分别使用532、785 nm激光获取的有机凝胶拉曼光谱，可见图5(a)有明显的荧光效应，图5(b)中荧光效应得到了有效抑制.

图5 有机凝胶拉曼谱图

4.4.2 荧光漂白

在拉曼光谱采集前，对于含有荧光成分的高分子或有机材料样品，可先用激光对待测区域照射一段时间，使荧光基团充分吸收光子，经过几个激发和发射周期后，样品的荧光会被不同程度的消减，照射时间从几秒到几小时不等.WIRE测试软件中有样品光漂白测量模式,根据样品和选用的激光情况进行设置即可.

4.4.3 荧光猝灭

在被测样品中加入猝灭剂，使样品与猝灭剂发生反应，降低荧光强度，由此可以达到抑制荧光背景的目的.

4.4.4 共焦模式

在WIRE测试软件中选择共焦模式下进行测量，采取降低激光辐照区域方式，也会大大降低荧光背景.

4.5 光谱信噪比低

有时获得的拉曼光谱信噪比低，使得拉曼特征峰不好辨识，发生此种情况先进行以下排查：首先检查样品是否聚焦准确，对于共焦显微拉曼光谱仪，样品不在焦平面上，会影响光谱信号强度，物镜倍数越高影响越大.其次检查显微物镜是否被污染，因为污染会造成通光率下降，尤其要检查短焦物镜是否在之前的测试中被污染而没有及时处理.最后检查软件是否设置了共焦模式.排除以上几种情况，则应归结为样品本身信号较弱，此时应适当提高激光功率或曝光时间，增加扫描次数，由此提高光谱信噪比，图6是提高激光功率前后的拉曼光谱对比.

图6 提高激光功率前后光谱对比

4.6 光谱信号太强

获得拉曼光谱有时会出现“冲顶”或特征峰显示不完整，图7显示了两种典型饱和拉曼光谱，这是因为检测物质的拉曼响应超出了仪器能够正常响应的范围.该情况可通过降低激光功率和减少曝光时间来避免.

图7 两种典型的饱和拉曼光谱

5 仪器的管理与维护

5.1 仪器维护

拉曼光谱仪属于精密光学仪器，所在的实验室环境要求防尘、恒温和不潮湿.实验室温度应全年24 h维持在20～27 ℃，相对湿度需低于50%.为防止外界振动源的影响，最好配有气垫光学防震台.设备不要靠近门、窗，以免震动或气流对系统产生影响，更不能置于空调出风口下，防止剧烈的温度变化或灰尘污染.为方便信号弱的样品的测试，实验室要具备一般暗室的功能.实验室管理员须根据天气变化，利用空调、除湿机控制实验室温度和湿度变化.要做好防尘工作，尽可能防止灰尘进入光谱仪内部，在打开光谱仪机盖时，必须戴口罩和手套.需更换滤光片、光栅、透镜组等光学元件时，须小心谨慎，保证其不受任何污染.灰尘、指印一旦触及光栅表面，会损害光栅并造成反射率的下降.在更换光栅时，先取下单色仪保护外壳，插上光栅保护罩，并使保护罩不碰到光栅表面，分开时要格外的小心，安装时如光栅表面不慎蹭有油渍或指纹，需要请专业人士在专业环境下清洗.若光学元件粘有灰尘，可用吸耳球吹掉或用干燥氮气吹掉.显微镜物镜在使用过程中容易被污染和损坏，应避免物镜镜头与样品直接接触、摩擦或磕碰.挥发性样品须密封，不可将物镜直接暴露在可能产生挥发物质的样品下，以免造成污染.对于粉体、液体、软膏、异形样品可优先选用同等放大倍数的长焦物镜，物镜一旦污染要及时处理.处理方式为：顺时针旋转物镜，卸下后倒立轻置在实验台上，用镜头纸或脱脂棉蘸取少量酒精，朝一个方向轻轻擦拭.激光器在同一天中不建议频繁的关闭启动，待一天的测试工作结束后再进行关闭，以延长激光器的使用寿命.对于不经常使用的紫外气体激光器，建议定期的开机，使其工作1～2 h，保持激光腔体内部气压平衡.光谱仪在工作一年以上之后，应在光栅座上的丝杠、滑杆等机械传动部件上滴一两滴轻机油.如滴油过多，应及时使用没有棉绒的纸或布擦去[13].长期使用和气候变化等的各种原因会导致仪器性能下降，特别是在供暖和空调开放前、后室温一般会发生较大变化.此时需要对光谱仪的光路进行必要的调整.

5.2 仪器管理

InVia-Reflex显微共焦拉曼光谱仪售价为数百万元，属于大型分析测试仪器，应由专人负责管理.凡有意向进行自主操机的人员，都须向设备管理中心提交培训申请表，经仪器管理员审核后确定培训人员名单，符合培训要求的人员都要参加由实验室管理员组织的专业培训，通过仪器培训考核合格后方可上机使用仪器.

获得自主操机权限的用户，在仪器的操作权限方面实行分级,普通的用户经过培训后可进行常温下的单点拉曼光谱采集和拉曼扫描成像测试，高级用户在普通用户的基础上，可进行安装变温样品台、通循环水、加液氮、更换偏振附件或光致发光附件等操作，进行原位变温测试、偏振测试、光致发光测试等.此外还有一些特殊需求的用户，如自己携带电化学工作站、高压装置等进行原位测试且耗时较长的用户，可在非工作时间自行预约机时进行测试.不能自主操机的用户，只能在工作时段进行时段预约，由管理老师进行测试.通过上述分级管理形式，既降低了人为造成的机器故障概率，同时延长了仪器有效测试机时，从而有效提高了仪器的运维效率[14].所有用户在操作过程中都应牢记操作注意事项并谨慎操作，试验结束后整理好仪器实验台桌面，确保卫生整洁，带走样品及所有相关物品，不得随意丢弃垃圾，有毒或有污染的特殊样品要严格遵守样品处理办法，最后在实验记录本上登记仪器使用起始时间、仪器使用后状态、使用人等信息[15-16].为防止仪器设备电脑中毒，禁止使用外来U盘拷贝实验数据，可以采用空光盘刻录或由相关负责老师使用E-mail发送.此外，设备管理人员应定期检查仪器状态，确保仪器稳定、高效率的运行.

6 结论

显微共焦拉曼光谱仪作为经典的材料分析测试仪器，其工作原理、使用方法、常见问题和解决方案对于相关研究人员进行拉曼测试具有很好的借鉴作用.本文以InVia-Reflex显微共焦拉曼光谱仪为蓝本，对上述关切点进行了介绍，特别是激光损伤样品、激光强度变化引起拉曼光谱特征改变、拉曼信号隐藏在强背底信号中等问题，进行了详细的成因分析，并给出了多种解决方案.此外，仪器的管理和维护对于设备的长期稳定运行尤为重要，本文对此也进行了详细阐述.