肠道菌群在高原低氧肠道损伤中的作用研究

王昱昊，施艺，李文豪，王舒，沈学锋，杨建军

1.空军军医大学西京医院消化外科，西安 710032；2.空军军医大学军事预防医学系劳动与环境卫生学教研室，西安 710032

随着海拔高度增加，大气氧分压逐渐下降、紫外线增强、气候愈发干燥寒冷，其中以高原低压低氧环境对机体健康影响最为突出，早期缺氧可引起机体中枢神经、呼吸、循环和消化等多系统出现应激损伤，严重可导致器官功能衰竭，甚至危及生命[1]。研究表明，进入高原地区，消化系统应激性症状出现较早，主要表现为胃肠道不适，如恶心、呕吐、腹泻、厌食等症状，主要由于机体在低氧环境中，交感-肾上腺髓质系统兴奋，儿茶酚胺分泌增多，导致血管收缩，胃肠黏膜血流减少，继而加重黏膜缺血缺氧程度，胃肠道氧供应减少，抑制胃肠道黏膜绒毛摆动，引起微血管损伤，通透性增加，最终导致胃肠黏膜屏障功能受损。其中低氧导致的肠道损伤，损伤程度与低氧暴露呈时间依赖性，尤以结肠为重，伴随终生，危害较重，但具体损伤机制仍不明确。机体肠道菌群菌种丰富，在维持肠黏膜屏障功能，平衡肠道内环境稳定起着重要作用；当肠道菌群平衡破坏，菌群出现比例、定位失调，屏障功能下降，细菌内毒素极易透过肠壁发生移位，最终导致肠道损伤[2]。因此，肠道菌群的稳态与机体肠道功能密切相关，低氧可破坏肠道菌群稳态，肠道菌群失调可能是低氧导致肠道损伤的机制。为此，本研究选取结肠为研究对象，通过小鼠高原暴露模型建立[1]，采用基因测序、形态学染色和RT-qPCR等技术研究高原低氧暴露条件下肠道菌群的变化，验证肠道菌群对肠道功能的作用，揭示肠道菌群在高原低氧环境中肠道损伤发生和发展中的作用，为寻找缓解和解决高原肠道相关疾病的方法，提供相关理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

电子秤（Mettler，德国），复合环境模拟实验舱（中航工业风雷，中国），核酸定量仪（Thermo Fisher，美国），基因扩增仪（Applied Biosystems，美国），实时荧光定量PCR仪（Thermo Fisher，美国），病理切片数字扫描仪（3D HISTECH，匈牙利），PAS染液套装（武汉赛维尔，中国），TRIzol RNA分离试剂（Thermo Fisher，美国），PCR试剂盒（TaRaKa，日本），反转录试剂盒（TaRaKa，日本）

1.2 动物模型的制备及分组

健康清洁级雄性8周龄C57 BL/6小鼠20只（空军军医大学(原第四军医大学)动物实验中心），体重（20.6±1.1）g，饲养于标准条件下（环境温度20～24℃，相对湿度45%～65%，12h昼/夜循环），自由饮水进食。适应性饲养5d后小鼠随机分为对照组和暴露组，每组10只，根据课题组的前期研究[1]，将暴露组小鼠放置在模拟海拔6000 m（大气压为349 mmHg，氧分压为8%～9%）的复合低压氧舱中，构建高原低氧环境暴露模型。两周后复测体重，取小鼠粪便进行测序分析。动物饲养和实验操作过程均符合第四军医大学实验动物使用伦理要求，编号：IACUC-20190402。

1.3 小鼠肠道菌群收集和16SrDNA测序分析

收集各组小鼠新鲜粪便（n=7）于无菌冻存管，液氮冷冻后存于-80℃冰箱备用，进行16SrDNA测序。使用通用引物341F和806R，并设计特异性引物进行Illumina Miseq PE250测序。F端序列（5’-3’）：CCTACGGGRSGCAGCAG（341F）；R端序列（5’-3’）：GGACTACHVGGGTWTCTAAT（806R）；得到425 bp左右扩增片段。扩增程序：①95℃预变性2 min；②95℃、55℃、72℃下变性、退火、延伸30 s，以上重复27个循环；③72℃稳定延伸5 min；④4℃保存。利用Illumina测序平台测定小鼠粪便中肠道菌群16S rDNA V3-V4区序列，分析比较小鼠肠道菌群的结构和多样性。

1.4 采集血液和收集结肠组织

低氧暴露14 d后，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40～60 mg/kg），充分麻醉后打开胸腔，心尖部位采血，采用全自动血细胞分析仪（BM800，北京）对血液标本进行生化分析。使用约20 ml生理盐水进行灌注，迅速分离出2 cm左右的结肠前段，利用0～4℃生理盐水冲洗干净肠内容物，截取一段结肠前段组织样本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，再依次使用15%和25%的蔗糖溶液进行脱水，石蜡包埋后连续切片，切片样本用于病理组织检测；其余结肠组织样本放入冻存管内，液氮冷冻后存放于-80℃冰箱。

1.5 结肠组织病理检测

将石蜡包埋切片脱蜡至水。采用苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）测量黏膜厚度和结肠隐窝深度；经糖原染色（Periodic acid-Schiff，PAS染色）后计数结肠组织隐窝内杯状细胞的数量。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）

剪碎小鼠结肠组织，充分碾磨后加入1 ml Trizol试剂，裂解结肠细胞提取RNA，反转录合成cDNA。本研究使用的引物序列如表1所示。PCR反应程序：①95℃预变性30 s，②95℃15 s，58℃变性、退火、延伸34 s，以上循环45次；③95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s稳定延伸。以β-actin为内参，采用△Ct法进行计算。

表1 实时定量PCR分析中的引物序列Tab.1 The primer sequence used in Realtime-PCRanalysis

1.7 统计学分析

采用CaseViewer软件观察结肠组织病理形态，分析评估结肠组织损伤程度，每份小鼠结肠组织样本选取15个定位良好的隐窝进行观察分析，测量结肠隐窝深度并计数结肠组织隐窝内杯状细胞数量。采用盲法进行肠道形态学评估和杯状细胞计数。

所有数据统计分析均采用SPSS 20.0完成。各组数据结果以均数±标准误（Mean±SEM）表示，根据数据是否满足正态分布，采用Student's t-test或Wilcoxon's rank-sum test比较两组间差异。采用置换多变量方差分析（PERMANOVA）以确定组间的整体微生物群落是否存在差异。相对丰度由线性判别分析LEf Se(Linear discriminant analysis Effect Size)以确定组间差异。当P＜0.05时，说明两组间存在显著的统计学差异。

2 结果

2.1 高原低氧环境对小鼠红细胞、血红蛋白和红细胞压积含量的影响

红细胞增多症是机体在高原低氧环境下的常见反应。因此，本研究首先对比分析了对照组和暴露组小鼠的血液生化指标。研究观察到暴露组小鼠的血细胞、血红蛋白和红细胞压积值明显高于对照组（见表2）。以上结果证明小鼠低氧暴露模型构建成功。

表2 小鼠红细胞、血红蛋白和红细胞压积含量的变化（n=6，均数±标准误）Tab.2 Changes of hematocrit red blood cell(RBC),hemoglobin(HGB)and hematocrit(HCT)values in mice(n=6,Mean±SEM)

2.2 高原低氧暴露对小鼠肠道菌群的结构组成和多样性的影响

2.2.1 小鼠肠道菌群多样性的比较 对两组小鼠粪便样本进行16SrDNA测序分析，实验结果表明：小鼠肠道菌群的α多样性在高原低氧暴露后显著下降，Observed species，Simpson和Shannon等指数显著降低（P＜0.01），但两组小鼠Converge指数差异不存在统计学意义；而两组小鼠肠道菌群在β多样性上同样存在显著差异，Bray-Curtis相异度的主坐标分析（PCoA）显示两组能够清楚地分离（R2=0.288，P=0.002）；且基于Bray Curtis的β多样性分析显示两组小鼠的肠道菌群存在显著性差异（P＜0.05），见图1。

图1 小鼠肠道菌群多样性分析（n=7）A：Observed species指数B：Simpson指数C：Shannon指数D：Converge指数E：β多样性主坐标分析（R2=0.288，P=0.002）F：基于Bray Curtis的β多样性分析*P＜0.01,#P＜0.05暴露组与对照组Fig.1 Analysisof gut microbiotadiversity in mice(n=7)A:Observed species index;B:Simpson index;C:Shannon index;D:Converge index;E:The principal coordinate analysis ofβdiversity(R2=0.288，P=0.002);F:Theβanalysisbaseon Bray Curtis;*P＜0.01,#P＜0.05 Exposuregroup vs Control group

2.2.2 小鼠肠道菌群门水平的物种组成 两组小鼠的肠道菌群种类在门水平上，以拟杆菌门和厚壁菌门为主。与对照组相比，暴露组小鼠的肠道菌群中拟杆菌门和疣微菌门的相对丰度显著升高，厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和柔膜菌门的相对丰度显著降低，同时两组小鼠肠道菌群中的的脱铁杆菌门和蓝藻门等相对丰度也不相同，见图2。

图2 门水平上小鼠肠道菌群的组成（n=7）A：各组小鼠肠道菌群门水平的物种组成B：各组小鼠肠道菌群门水平比较*P＜0.05，#P＜0.01，暴露组与对照组Fig.2 Thecomposition of gut microbiotain miceat thephylum levels(n=7)A:The relative abundance of bacteria at phylum levels in each group;B:Comparison of bacteria at phylum levels in each group；*P＜0.05,#P＜0.01 Exposuregroup vs Control group

2.2.3 小鼠肠道菌群属水平的物种组成 为了进一步分类两组小鼠的肠道菌群，本研究还进行了LEfSe差异分析，14个属在两组之间显示出显著差异（线性判别分析得分＞3.0，P＜0.05）。与对照组相比，暴露组小鼠的肠道菌群中艾克曼菌属、拟杆菌属、普雷沃氏菌属、梭状芽胞杆菌ⅩⅧ和瘤胃球菌属的相对丰度显著升高，而罗斯氏菌属、Odoribacter菌属、Lachnospiracea菌属、脱硫弧菌属、梭状芽胞杆菌ⅩⅣa、梭状芽胞杆菌Ⅳ、Butyricicoccus菌属、螺杆菌属和欧氏菌属的相对丰度显著下降，见图3。

图3 小鼠肠道菌群属水平物种的组成和比较（n=7）A：小鼠肠道菌群的差异菌属热图B：各组小鼠肠道菌群属水平的物种组成C：LEf Se差异分析的各组小鼠肠道菌群属水平物种差异D：小鼠肠道菌群差异菌属柱状图Fig.3 The composition of gut microbiota in mice at the genus levels(n=7)A:The heatmap of different bacteria of gut microbiota in mice at the genus levels;B:The relative abundance of bacteria at genus levels in each group;C:Differences in microbial taxaat genus level between each group werecalculated by LEfSe;D:Comparison of bacteriaat genuslevelsin each group

2.3 高原低氧暴露对小鼠肠道结构的影响

对照组小鼠的结肠组织结构完整，黏膜层内隐窝排列整齐，可见杯状细胞，黏膜层和黏膜下层未见炎症细胞浸润，未见明显病理变化；暴露组小鼠结肠组织上皮连续性中断，与对照组相比，暴露组隐窝深度明显缩短（P＜0.01），腺体出现萎缩。与对照组小鼠结肠隐窝内杯状细胞数量相比，暴露组明显减少。对照组小鼠杯状细胞富含黏蛋白，胞体充盈，暴露组杯状细胞黏蛋白含量显著减少，见图4。

图4 小鼠结肠组织HE染色和PAS染色A：HE染色B：小鼠结肠隐窝深度柱状图C：PAS染色 D：小鼠结肠杯状细胞数量柱状图（n=6，均数±标准误）A，C：×50，×200，*P＜0.01，暴露组与对照组Fig.4 Colon tissue of mice with HEand PASstainingA:HE staining;B:Histogram of colonic crypt depth in mice(n=6);C:PASstaining;D:Histogram of thenumber of goblet cells in mouse colon(n=6,Mean±SEM)；A,C:×50,×200,*P＜0.01,Exposuregroup vs Control group

2.4 高原低氧暴露对小鼠结肠组织炎症因子和紧密连接蛋白mRNA的影响

与对照组相比，暴露组小鼠结肠组织炎症因子白介素6（Interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factorα,TNFα）的mRNA表达量显著上升（P＜0.05）；紧密连接蛋白Occludin和带状闭合蛋白（zonula occludens-1,ZO-1）的mRNA表达水平下降（P＜0.05）。研究结果提示高原低氧暴露后小鼠结肠肠道屏障受损并出现炎症，见图6。

3 讨论

高原低氧的特殊环境对高原旅居者来说是一个挑战，在高原低氧环境暴露会对人体多种器官造成损害，特别是肠道系统[3]。因此，肠道系统疾病在高原人群中发病率较高[4]。高原低氧导致的肠道黏膜损伤是引起高原肠道疾病发生和发展的重要因素。张伟等人研究发现，高原低氧暴露可显著加重小鼠结肠炎症及其黏膜损害，并影响小鼠免疫功能[5]。以往研究表明，高原低氧通过引起内分泌、免疫和中枢等多系统功能紊乱影响机体肠道功能，短期内可导致纳差、腹胀等肠道症状，长期可引起消化道出血和穿孔，甚至危及生命，但其确切的内在机制仍不清楚[5,6]。

越来越多的研究证实，肠道菌群在维持肠道稳态和健康方面以及参与肠道疾病发生发展中起了重要作用。结构稳定、组成多样、益生菌为主导的肠道菌群有利于宿主消化和代谢功能、肠黏膜屏障的调节、免疫系统的发育和成熟，以及对病原体的防护；相反，结构紊乱、多样性下降、致病菌为主导的肠道菌群损害宿主健康，现已证明肠道菌群紊乱在炎症性肠病、肠易激综合征、结直肠癌等多种肠道疾病的发生发展中发挥了重要的调控作用[7,8]。高原低氧环境对宿主肠道菌群结构有快速而持久的影响，可导致宿主肠道菌群紊乱[9]。因此，肠道菌群紊乱可能是高原肠道疾病的诱因或重要调节环节，但作用机制不明。

本研究发现，与对照组相比，高原低氧暴露组小鼠的肠道菌群中艾克曼菌、普雷沃氏菌和梭状芽胞杆菌XVⅢ的菌属相对丰度显著升高。艾克曼菌是一种黏蛋白降解菌，在人体肠道中以黏蛋白为主的黏液层可以保护肠道免受肠道菌群中致病菌的渗透[10]。因此，艾克曼菌的丰度升高是对肠道黏液层的一种潜在威胁因素[11]，这与本研究中观察到的暴露组小鼠结肠组织杯状细胞数量减少、细胞内黏蛋白充盈量显著下降的实验结果相一致。此外，大量研究证据表明肠道菌群中艾克曼菌、普雷沃氏菌和梭状芽胞杆菌含量上升可引起肠道炎症，导致腹泻、结肠炎，严重者甚至引发死亡[12]。与本研究结果相一致，本研究结果进一步发现，暴露组小鼠结肠组织IL-6和TNFα炎症因子水平显著升高，提示高原低氧暴露可引发小鼠肠道菌群中的致病菌相对丰度升高，从而导致肠道组织损伤和肠道炎症。

图5 小鼠结肠组织炎症因子和紧密连接蛋白mRNA表达量（n=6，均数±标准误）A：IL-6 mRNA相对表达量B：TNFαmRNA相对表达量C：Occludin mRNA相对表达量D：ZO-1 mRNA相对表达量*P＜0.01,#P＜0.05暴露组VS对照组Fig.5 The mRNA expression of IL-6,TNFα,Occludin and ZO-1(n=6,Mean±SEM)A:The mRNA expression of IL-6;B:The mRNA expression of TNFα;C:The mRNA expression of Occludin;D:The mRNA expression of ZO-1；*P＜0.01,#P＜0.05 Exposuregroup vs Control group

高原低氧暴露导致小鼠肠道菌群中致病菌相对丰度上升，而益生菌的相对丰度降低。特别是短链脂肪酸产生菌，主要包括罗斯氏菌、Odoribacter菌、Lachnospiracea菌、Butyricicoccus菌和欧氏菌的相对丰度显著下降。研究证实短链脂肪酸有缓解炎症，降低血压，改善宿主代谢和增强结肠上皮屏障功能的作用[13]。肠道屏障结构的完整性是维持肠道正常生理功能，阻止有害物质通过肠黏膜进入宿主体内的物质和结构基础。研究结果显示，高原低氧暴露组小鼠结肠组织的上皮连续性中断，腺体出现萎缩，隐窝变短，肠道结构和黏膜屏障遭到破坏；而肠道黏膜的损伤以及紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的相对mRNA水平降低，提示高原低氧环境导致的肠道菌群紊乱可能是破坏肠道黏膜屏障关键因素。其中，致病菌和黏液降解菌相对丰度的增高，益生菌的减少可能是引起高原低氧环境中小鼠肠道损伤的根本原因。高原低氧环境可造成小鼠肠道菌群紊乱，致病菌含量上升，益生菌含量下降，可能是引起肠道炎症，破坏肠道黏膜屏障并最终导致肠道损伤的关键因素。

综上，高原低氧环境导致的肠道菌群紊乱可能参与小鼠肠道黏膜损伤。健康的肠道黏膜依赖于完整的肠道屏障结构，肠道屏障由机械屏障、生物屏障、免疫屏障和化学屏障组成。高原低氧环境导致的黏膜损伤可能源于肠道菌群紊乱引起的生物屏障破坏，也可能源于高原低氧环境直接导致的各类屏障损伤，因此菌群紊乱是否直接损伤肠道黏膜仍需进一步研究。在下一步研究中，以“菌群-代谢物-肠道疾病”为研究方向，探讨肠道菌群在高原肠道疾病中的作用机制，探寻特异性益生菌及其相应代谢产物，有望为相关高原肠道疾病提供新的预防和治疗策略。