端锚聚合酶抑制剂的作用方式以及药效团模型的构建

温泽宇，于大永，王 柳，史丽颖

（大连大学生命科学与技术学院，辽宁 大连116622）

Wnt信号通路是由配体蛋白质Wnt与膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径，在胚胎发育和多种癌症的形成过程中起着至关重要的作用[1].在Wnt通路中，β-catenin裂解复合物是一种重要的调节因子，由Adenomatous polyposis coli（APC）、轴抑制蛋白（axin）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）和酪蛋白激酶1α（CK1α）组成，它严格控制着β-catenin的水平[2].在Wnt信号没有被激活的情况下，细胞质中的β-catenin保持在较低水平.在大多数癌细胞中可观察到Wnt信号通路被异常激活，β-catenin裂解复合物发生降解，使得β-catenin积累并且移位到细胞核中[3-4].Axin蛋白是Wnt信号通路的负反馈调节因子，可降低β-catenin的水平，抑制Wnt通路基因转录.有研究报道[5-8]，端锚聚合酶（tankyrase，TANKS）可以降低Axin蛋白的表达量，它是多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）家族的一员.端锚聚合酶抑制剂可使Axin蛋白积累，进而降解β-catenin，阻止其向细胞核转运并降低Wnt通路基因的表达[9].端锚聚合酶能够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）为底物，生成附着在靶蛋白上的ADP-核糖聚合物.TANK1和TANK2是端锚聚合酶的2个异构体，蛋白序列高度保守，同源性高达80%[10-11].同PARP家族其他成员类似，端锚聚合酶的催化结构域由1个结合并水解NAD+的供体位点和1个容纳目标蛋白的受体位点组成，供体部位含有烟酰胺位点和腺苷位点[12-13].供体位点构象的特征是封闭且灵活，当供体位点与NAD+或抑制剂结合时，端锚聚合酶D环上具有灵活构象的氨基酸被动发生移位，允许NAD+或抑制剂进入沟槽[14-15].自20世纪70年代以来，许多研究[16-18]发现，在PARP家族成员中高度保守的烟酰胺位点是端锚聚合酶抑制剂（如xav939）作用的唯一靶点.最近研究发现[19]，一种新型的抑制剂（IWR1）可结合在TANK1的腺苷口袋中，与结合口袋周围氨基酸的作用方式相比于其他PARP家族成员较为保守，表明此类抑制剂对端锚聚合酶具有很高的选择性.腺苷口袋是由α3螺旋和D环上的氨基酸Phe1188运动产生的，定义腺苷口袋的结构特征和结合模式对于开发高选择性且强效的端锚聚合酶抑制剂具有重要指导意义.

为了深入了解端锚聚合酶腺苷位点处抑制剂的作用方式，本研究从文献[12-15，20-21]中选取活性和非活性抑制剂组成训练集和测试集，训练集用来构建基于配体共同特征的药效团模型，测试集用来验证模型的准确性.将活性抑制剂对接于腺苷结合位点，研究活性抑制剂的作用模式，对比分析关键氨基酸与活性抑制剂的普遍作用模式.将分子对接结果与药效团模型结合，进一步构建更精确的药效团模型，反映抑制剂对腺苷位点的关键作用方式以及作用模式.该药效团模型可用于端锚聚合酶抑制剂的开发和筛选.

1 材料与方法

1.1 小分子的制备

根据文献[12-14，20]，选择15种端锚聚合酶抑制剂作为训练集，构建基于配体共同特征的药效团，15种抑制剂的结构如图1所示，其活性如表1所示.

表1 训练集中抑制剂的活性Tab.1 Activity of the inhibitors in the training set

图1 训练集中抑制剂的结构Fig.1 Molecular schematics of the inhibitors in the training set

这些小分子结构用SYBYL6.9.1中的Steepest Descent算法进行叠加和优化，然后采用共轭梯度和牛顿-拉夫森算法优化，收敛梯度分别为0.4、0.04和0.004 kJ/mol[22].随机选用抑制剂1、5、7、9、11和13进行分子对接实验.

1.2 共同特征药效团的建模和验证

以15种抑制剂作为训练集，在InsightⅡ软件中，利用HipHop模块生成基于配体共同特征的药效团.在参数设置上，选择氢键供体（D）、氢键受体（A）、疏水基团（H）、共轭环（R）和正电离中心（P）5个特征.设置药效团的构象最多生成数为10.此外，参考训练集的活性数据，设置“Principal”值为2，“MaxOmitfeat”值为1，其他参数设置为默认值.

在Ligand Profiler模块中，通过由11个活性端锚聚合酶抑制剂和6个非活性抑制剂组成的测试集验证药效团，测试集化合物的活性如表2所示.为了将测试集的所有配体与药效团匹配，设置maximum omitted features为0，其他参数设置为默认参数.

表2 测试集中抑制剂的活性Tab.2 Activity of the inhibitors in the test set

1.3 蛋白准备

从蛋白质数据库（http：//www.rcsb.org/pdb/）下载TANK1（PDB：4K4F）[23]的晶体结构.利用Schrodinger软件删除蛋白中的水分子，加入晶体结构缺失的氢原子和氨基酸残基，在pH值为7.4的环境下，对氨基酸的质子化带电状态进行调节.通过原子力场OPLS2005，将晶体结构的氢原子能量最小化.

1.4 分子对接

分别利用Glide、AutoDock 4.2和AutoDock Vina 1.1软件，将训练集中的15个小分子抑制剂与TANK1蛋白对接.以晶体结构中天然配体的位置为活性中心，坐标位置：x=-8.89，y=41.75，z=27.93.在AutoDock中，设置活性位点口袋大小为4 nm×4 nm×40 nm.利用Glide中的SP和XP这2种对接精度进行对接.

2 结果与分析

2.1 共同特征药效团

以15种端锚聚合酶抑制剂为训练集，利用HipHop模块生成基于配体共同特征的药效团，结果如表3所示.药效团假设大致可分为4类：RHAAA（01、02、03）、HHAAA（04、05、06）、RHHAA（07、08、10）、RRHHA（09）.产生的10个药效团得分范围为177.785~193.601.

表3 由HipHop模块生成的共同特征药效团Tab.3 Pharmacophore based on the common features generated by the HipHop

2.2 验证药效团模型

为了获得更准确的药效团，利用测试集对药效团进行测试.将测试集映射到药效团上，得到了1个热度图，如图2（a）所示.测试集和药效团的拟合值可以用热度图中的颜色条表示：蓝色代表低拟合值，绿色代表中等拟合值，黄色、橙色和红色代表高拟合值，黑色和白色分别代表最低拟合值和最高拟合值.根据对热度图结果的分析，在假设8（Hyp08）中，活性抑制剂A1—A11的拟合值高于非活性抑制剂B1—B6的拟合值.假设8的结构如图2（b）所示.

图2 测试集对药效团的测试结果Fig.2 Test result of the test set against pharmacophore models

为了进一步研究构效关系，从训练集中选择了6种抑制剂（抑制剂1、3、5、9、10和14）映射到假设8，结果如图3所示.由图3可以看出，大多数抑制剂可以与药效团模型相匹配，其中，吡咯和苯环映射到共轭环（R）特征，疏水基团（H1和H2）与苯环和环己烷相匹配，氢键受体（A1和A2）与羰基、吡啶、三唑烷和乙腈匹配.抑制剂5和抑制剂9与氢键受体（A1）不匹配.该药效团模型能够反映出抑制剂的结构特征，但未考虑抑制剂在蛋白质活性部位的构象因素，因此还需要用分子对接结果优化该药效团模型.

图3 药效团特征在6个具有代表性的抑制剂上的2D映射Fig.3 2D mapping of the pharmacophore features onto the six representative inhibitors

2.3 分子对接

用4种不同的对接方法将15种抑制剂与TANK1（PDB：4K4F）腺苷位点对接.首先对方法进行评价，分别利用4种对接方法将TANK1与天然配体进行对接.将对接后的天然配体与原天然配体构象进行比较，分析两者之间的均方根偏差（RMSD）.4种对接结果的RMSD值：AutoDock为0.633 nm，AutoDockVina为0.537 nm，Glide SP为0.486 nm，Glide XP为0.436 nm.RMSD值均低于2 nm，因此认为4种对接方法均合理.分别利用4种对接方法将15种抑制剂与TANK1腺苷位点对接，结果如表4所示.将4种对接软件的对接分数值同活性数据进行对比，与AutoDock和AutoDockVina相比，Glide对接程序的对接数据与活性数据的相关性更高.在对接模拟过程中，Glide XP的对接精度设置优于SP，因此，在后续的作用方式研究中，选取Glide XP对接构象进行研究.

表4 不同软件的对接结果Tab.4 Summary of the docking results in different software（kJ/mol）

为了进一步分析抑制剂与端锚聚合酶的结合方式，将部分抑制剂（1、3、5、9、13）叠合在腺苷位点上，结果如图4所示.抑制剂的骨架符合腺苷位点的形状，深入占据了腺苷口袋的A、B、C 3个位点.TANK1的活性位点如图5所示.从训练集中选择抑制剂1、5、7、9、11和13与TANK1进行互作模式分析，抑制剂与TANK1活性部位对接的结果如图6所示.

图4 TANK1抑制剂于腺苷活性口袋处排列的三维视图Fig.4 Three-dimensional view of the TANK1 inhibitors arranged in the adenosine active pocket

图5 TANK1活性位点示意图Fig.5 Schematic representation of the TANK1 active site

抑制剂1与腺苷位点的相互作用如图6（a）所示.在A位点处，恶唑啉酮上的羰基与Tyr 1213形成氢键，Phe 1208、Tyr 1203和Ile 1228与恶唑啉酮上的甲基和苯环形成疏水作用，Phe 1188与苯环形成π-π共轭作用.在C位点处，Asp1 198和Gly 1196分别与酰胺上的羰基和喹啉6位的—CH形成氢键.喹啉与其对立位置D环上的His 1201形成π-π共轭作用.

在C位点处，抑制剂9、11和13（图6（b）、图6（c）、图6（d））与抑制剂1不同，它们以更稳定的基团取代氨基喹唑啉酰胺，这些基团与Asp 1198和Gly 1196形成氢键.抑制剂9和抑制剂11的嘧啶以及抑制剂13的苯环都与D环上的His 1201形成共轭作用.抑制剂11和抑制剂13含有环己烷，而抑制剂9含有苯环，在B位点处的对接构象显示，抑制剂9中心的苯环垂直于吡啶环，这种特殊构象能够使抑制剂的吡啶深入填充到由TANK1的Ser 1186、Phe 1188和Ala 1202形成的疏水沟槽中，形成更强的疏水作用.

图6 抑制剂与TANK1活性部位的对接Fig.6 Docking of inhibitors into the active site of TANK1

抑制剂5和抑制剂7（图6（e）和图6（f））与其他抑制剂的构象差异显著，但在A和C位点处，仍可以观察到三唑胺和恶唑上的氮原子与Tyr 1213和Asp 1198形成氢键，苯环与D环上的Phe 1188和His 1201形成共轭作用.在A位点处，TANK1 apo结构上Tyr1213的苯环与抑制剂甲氧基苯中的苯环重叠，这种构象可能会增加抑制剂的效力.

2.4 建立腺苷位点内的相互作用模型

基于配体共同特征生成的药效团模型假设08被映射到6种抑制剂上，除抑制剂5和抑制剂9外，其余4种抑制剂与药效团特征相匹配.观察药效团模型与抑制剂的匹配情况，发现药效团模型与分子对接结果不能完全匹配.用分子对接结果对药效团模型进行评价，可以获得更准确的药效团模型.总结分子对接实验发现，抑制剂在腺苷位点处的结合模式较保守：抑制剂与A位点上的Tyr1213、C位点上的Asp1198和Gly 1196形成3个关键的氢键，在C位点处，抑制剂与对立位置的His 1201形成共轭作用.在药效团模型假设08（RHHAA）的5个特征中，氢键受体特征都在C位处，同时缺失能与D环上His 1201形成共轭作用的特征.

为了获得更准确的药效团，将与TANK1对接后的抑制剂叠合起来，保持其在活性部位的构象，将这些抑制剂分为2组：抑制剂1~8为第1组，抑制剂9~15为第2组.使用相同的参数设置构建药效团.第1组药效团包含6个特征，得分范围为100.868~121.789，新模型中假设f（RHHAA）具有最佳的相关性；第2组药效团包含5个特征，得分范围为55.643~73.967，假设a（RHHDA）具有最佳的相关性.将2个药效团叠加，得到了精确的药效团模型（RRHHAAD），如图7所示.

图7 精确药效团假说在TANK1活性位点上的叠加Fig.7 Superimposition of the refined pharmacophore hypothesis onto the TANK1 active sites

在该药效团中，3个保守氢键特征分布在腺苷口袋的A和C位点处，这与分子对接实验得到的保守结合模式一致；2个共轭环（R1和R2）特征分别定义在A和C位点处，与Phe 1188和His 1201形成共轭作用；腺苷位点的中心（B位点）处有1个关键的疏水特征（H2）；另外，模型还有2个氢键受体特征（A1和A2）和1个氢键供体特征（D）.这些关键特征在提高抑制剂的活性和稳定性方面起着至关重要的作用，叠加后得到的药效团可以准确反映腺苷位点的特征，也可以解释抑制剂与端锚聚合酶的互作方式.

3 结论

本研究选取了15种端锚聚合酶抑制剂，先根据抑制剂的共同特点生成了具有5个特征的药效团假设08（RHHAA）：2个疏水特征、1个芳香环、2个氢键受体.随后从训练集中选择了6种抑制剂映射到药效团上，发现有2种抑制剂与药效团模型不匹配.将15种活性抑制剂与TANK1对接，分析分子对接结果，推测抑制剂若能够占据B位点与周围氨基酸残基形成广泛的疏水相互作用，同时与Tyr 1213、Asp 1198和Gly 1196形成氢键，则具有良好的活性.将分子对接结果与药效团假设08进行比较，结果显示分子对接结果与药效团假设08特征不能完全匹配.为了获取更加精准的药效团模型，以分子对接产生的抑制剂构象为基础，将15种抑制剂分为2组，根据基于配体共同特征生成的药效团，对比药效团假设08的化学特征以及各特征位置，保留药效团08原有特征并融合新构建的药效团模型特征，最终得到了一个更加优化的药效团（RRHHAAD）.在该药效团中，3个保守氢键特征分布在腺苷口袋的A和C位点处，2个共轭环（R1和R2）特征分别定义在A和C位点处，与端锚聚合酶的Phe1188和His1201形成共轭作用；腺苷位点的中心（B位点）处有1个关键的疏水特征（H2）；另外，模型中还有2个氢键受体特征（A1和A2）和1个氢键供体特征（D）.该药效团与分子对接结果一致，能更好地反映端锚聚合酶腺苷活性位点的特征.