1例Rhmod个体的RHAG基因分析

黄娴 李立新 李双玉 吴丽娜 解金辉

Rh血型系统（ISBT004）包含RHD和RHCE两个同源连锁基因，分别编码D抗原和CcEe抗原，是最重要的红细胞血型系统之一。RHAG血型系统（ISBT030）由RHAG基因编码Rh相关蛋白RhAG，RhAG蛋白对RhD/CE抗原在红细胞膜上的正确连接定位十分重要[1]。RHAG基因变异可导致Rh血型抗原显著减少，称为Rhmod[2]。我们通过1例由于RHAG新复合杂合突变导致的Rhmod家系进行血清学与基因检测，并采用生物信息学方法和蛋白结构模型，初步探讨这例新的复合突变导致Rhmod型的分子基础。

材料与方法

1 研究对象 Rhmod型家系来自天津，先证者父亲已故，无兄弟姐妹子女，直系亲属仅现存母亲。先证者，女，18岁，无输血史和妊娠史，因溶血性黄疸收住入院，总胆红素51 μmol/L，间接胆红素27 μmol/L，血红蛋白93 g/L。医院初检为Rh阴性，送检血液中心进行交叉配血，为切脾手术备血。

2 试剂与仪器 抗C、c、E、e（CE-IMMUNODIAGN OSTIKA公司），抗D试剂4种（上海血液生物，加拿大宜美康，CE-IMMUNODIAGNOSTIKA，Sanquin），DNA提取试剂盒（Magen公司），Taq DNA聚合酶（Takara公司）。微柱凝胶抗球蛋白检测卡、孵育器、卡式离心机（BIO-RAD公司），离心机（KUBOTA公司），分光光度计（IMPLEN公司），PCR仪（ABI公司），电泳仪（Thermo公司），凝胶成像仪（北京东讯天地）。所有试剂与仪器均在有效期内使用。

3 方法

3.1 Rh抗原检测：采用试管盐水法、微柱凝胶卡法，使用4种克隆株的抗D试剂检测先证者RhD抗原。用吸收放散试验检测其红细胞是否表达微量的D抗原，放散法使用Sanquin公司的酸放散试剂盒。由于样本量所限，未进行RhCE抗原的吸收放散试验。采用试管盐水法和微柱凝胶卡法检测所有受试者的RhCE抗原、不规则抗体筛查和直抗。

3.2 DNA提取及PCR扩增：采用蛋白酶K法抽提所有受试者的外周静脉血DNA，检测抽提DNA的浓度和纯度。自行设计RHD、RHCE、RHAG基因所有外显子的PCR引物（由Invitrogen公司合成），寻最适条件进行PCR-SSP。

3.3 DNA测序分析：RHD、RHCE、RHAG的PCR扩增产物送Invitrogen公司测序，测序引物使用扩增引物。测序结果用Choromas软件与ISBT公布的RHD（NG_007494）、RhCE（RhCE*ce，NM_020485）、RHAG（NG_011704）基因序列进行比对。先证者母亲进行相同的PCR扩增和RHAG基因测序。

3.4 生物信息学分析：使用PolyPhen-2和Provean两个在线生物信息学软件，分析氨基酸变异对蛋白质功能的影响。运用PyMOL软件，对变异氨基酸进行空间定位，并分析其与周围氨基酸的氢键作用。

结 果

1 血清学检测结果 先证者D、C、c、E、e抗原盐水法、微柱凝胶卡法均为阴性，分析可能为Rh抗原系统抗原不表达（Rhnull表型）或弱表达（Rhmod表型）。吸收放散试验显示D抗原为阳性，先证者符合Rhmod表型。其母亲Rh抗原未见明显异常，Rh血型为ccDEE。先证者和母亲抗筛、直抗均阴性。

2RHD和RHCE基因变异检测结果 先证者RHD基因1-10外显子及剪切点区域未发现突变，RHCE*01.01第1外显子存在48G＞C（Trp16Cys），是常见的RHCE等位基因。

3RHAG基因变异检测结果 如图1所示，先证者RHAG基因第3外显子编码第142位氨基酸的碱基发生c.425T＞C，使亮氨酸转为脯氨酸（p.Leu142Pro），第8外显子编码第376位氨基酸的碱基发生c.1126G＞A，使甘氨酸转为苏氨酸（p.Gly376Ser），两处变异均为杂合错义突变。先证者母亲RHAG基因第8外显子也存在c.1126G＞A。

图1 先证者RHAG基因测序结果

4 生物信息学分析结果

4.1 蛋白影响力评估：如图2所示，p.Leu142Pro变异PolyPhen-2评分结果为0.999分，Provean评分结果为-6.220分；p.Gly376Ser变异PolyPhen-2评分结果为1.000分，Provean评分结果为-5.580分，预示这两处变异均为有害变异，可影响蛋白质功能。

图2 2种生物信息学软件对氨基酸变异预测结果

4.2 变异位点空间结构分析结果：PyMOL模型分析显示，RhAG蛋白有12个α-螺旋，p.Leu142Pro位于第5个α-螺旋跨膜区域接近胞内处，p.Gly376Ser位于第12个α-螺旋跨膜区域，如图3所示。图4为氨基酸变异前后氢键的比较，p.Leu142变为p.Pro142后，与p.Pro138的氢键作用消失；p.Gly376变为p.Ser376后，增加p.Ala372、p.Val373、p.Leu377位之间的3个氢键。分析显示2处变异均可能改变氨基酸间氢键的联系。

图3 RhAG蛋白三维空间结构模型

图4 氨基酸变异前后氢键比较

讨 论

RHAG基因位于6号染色体长臂6p11-p21. 1，它编码的RhAG抗原蛋白含409个氨基酸，12次穿膜，N端和C端都在膜内[3]。RhAG蛋白是膜上多聚体的主要成分之一，与RhD、RhCE、GPB、GPA、CD47、LW、带3蛋白和带4.2蛋白组成蛋白复合物[4]。如果RhAG抗原不能正常表达，不仅造成RhD/CE蛋白不能正常穿膜，还会造成红细胞塌陷，口形和球形红细胞增多[5]，细胞水分过多和阳离子外流[6]，红细胞在体内存活期缩短，个体易发生轻到中度的代偿性溶血性贫血[7-8]，少数重度病例在脾切除术后仍有溶血症状[9]。本文中先证者患有溶血性黄疸，可能与RHAG基因变异有关，脾切除手术未输血，术后溶血和贫血症状减轻。

Rh缺失型可分为无效等位基因型（amorph type）及调节型（regulator type）。Rhmod属于调节型，RHD/CE基因正常，但RHAG是无活性的突变纯合子或双杂合子[10]。本文中先证者的RHAG基因外显子存在425T＞C和1126G＞A两处变异，均为杂合错义突变，导致Rh抗原表达显著减少的Rhmod型。Rhmod型案例罕见，目前国际上报道的Rhmod型有RHAG1183delA、RHAG3G＞T、236G＞A[11]、 398T＞C、572G＞A[12]和707A＞C等，比对国内外文献和NCBI、ISBT数据库网站，未发现本文中RHAG两处位点变异的报道，为新的基因变异。

先证者的两处变异，1126G＞A遗传自母亲，先证者父亲已故无法测序且无兄弟姐妹子女，推测425T＞C可能遗传自父亲。而先证者母亲Rh抗原未见明显异常，母亲应为携有一条正常RHAG基因，一条变异基因。进一步试验可检测先证者及母亲RhAG及其它相关蛋白的表达水平，还可构建突变细胞体外分析变异对蛋白表达的影响。本文三维模型显示先证者1处变异氨基酸位于α-螺旋跨膜区域接近胞内区，2处变异均可能改变氨基酸分子间作用，蛋白功能预测软件预测为有害，推测其可能影响其与RhD/CE蛋白在胞内结合形成多聚体而不利于RhD/CE蛋白跨膜，为探索Rhmod的分子机制提供启示。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突