RhD血型初检阴性孕妇RHD基因分型及同种免疫研究*

马玲 吴敏慧 赵芳 史丽莉

在已知的43个人类红细胞血型系统中，Rh血型系统最为复杂，且可以导致新生儿溶血病（hemolytic disease of fetal and newborn，HDFN）和溶血性输血反应，临床意义仅次于ABO血型系统。其中RhD抗原免疫原性最强，相应的抗D是导致严重HDFN的主要抗体[1]。临床上对于RHD-HDNF的预防措施主要是定期进行抗体筛查，同时及时给予抗D免疫球蛋白治疗。中国人的RhD抗原变异型较多，根据抗原表达数量和性质的差异，大致可分为弱D、部分D以及东南亚常见的Del型等。各种RhD变异型基因背景不一，机体免疫状态及临床风险也不同。例如有观点认为，亚洲型DEL（分子遗传背景为RHD基因exon9 c.1227G＞A同义突变）孕妇中，未发现抗D抗体产生，建议该型孕妇可以免去孕期频繁地抗体筛查和抗D免疫球蛋白注射[2-3]。因此，明确各亚型临床意义非常重要，对于孕妇RhD抗原变异型及母婴间同种免疫开展研究，可以为RhD-HDFN的诊断、预防提供重要的实验室指标。

关于RhD阴性孕妇的同种免疫情况已有一些报导[4-6]，但是相关资料积累分析还远不够，目前临床对RhD阴性孕妇免疫血液学检测及管理认识有限，操作不统一[7]。本文对2018～2020年至本中心的RhD血型初检阴性孕妇进行RHD基因分型及同种免疫状况分析研究，尤其关注亚洲型DEL的情况，为RHD-HDFN诊断及建立早期干预共识进一步积累相关资料，现报道如下。

资料与方法

1 一般资料 2018年10月～2020年9月于本中心进行产前检查的孕妇108例，年龄21～41（中位数：29）岁；RhD血型初检结果均为阴性，采外周静脉EDTA抗凝血及不抗凝血各约3 mL；经本人知情同意。

2 仪器与试剂 IgG/IgM型抗D试剂（分别为：Sanquin，荷兰；Dominion，加拿大）；IgG型抗D试剂、IgM型抗C、抗c、抗E、抗e试剂、抗球蛋白试剂（IgG+C3d）、筛选细胞及谱细胞（上海血液生物医药有限责任公司，中国）；基因组DNA提取试剂盒（原平皓公司，中国）；2×Taq PCR Mix（博尔迪生物，中国）；人类红细胞RHD基因分型试剂盒（PCR-SSP）（天津秀鹏生物技术，中国）；上述试剂均在有效期内使用。Labofuge 400R低温高速离心机（Heraeus Corp. 德国）；血型血清学专用离心机（久保田，日本）；ND-100-Spectrophotometer DNA定量分析仪（NanoDrop Corp. 美国）；Alphalmager HP凝胶成像系统（Applied Biosystem，美国）。

3 方法

3.1 Rh表型鉴定：使用3种不同厂家IgG或IgM/IgG型抗D试剂，采用盐水或间接抗人球试验的方法进行RhD阴性确认。采用IgM型抗C、抗c、抗E、抗e试剂，分别进行RhCcEe表型鉴定。

3.2 抗体筛查及鉴定：按照常规血清学方法，采用盐水法及间接抗人球方法对患者血清进行意外抗体筛选；对于抗体筛查阳性者进行抗体鉴定试验；同时采用倍比稀释法进行抗体效价测定，参考文献[8]方法，以“1+”凝集的最高稀释度管为滴定终点，记录效价值。

3.3 DNA提取及RHD基因分型：离心吸取孕妇白膜层细胞，按照DNA提取试剂盒操作要求，提取基因组DNA。所有样本采用商品化RHD阴性鉴定基因检测试剂盒（PCR-SSP法）进行RHD基因分型，根据说明书，该试剂盒可以有效地鉴定RHD*01N.01、RHD*01N.03、RHD*15、亚洲型DEL及RHD*06.03.01型。PCR反应条件为： 96℃ 2 min，随即96℃ 20 s，68℃ 60 s，5个循环；96℃ 20 s，65℃ 50 s，72℃ 45 s，10个循环；96℃ 20 s，62℃ 50 s ，72℃ 45 s，15个循环；72℃，5 min，最后4℃保存。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳（100 V，30 min），用凝胶成像系统分析结果。

3.4 RHD基因测序：对于血清学与基因分型结果有疑问的标本，进一步进行测序分析。参考文献方法[9]，对RHD基因10个外显子进行测序分析，测序引物同扩增引物，均由上海生工生物工程股份有限公司合成。 PCR总体积为20 μL，引物浓度为200 nM，PCR条件为：95℃，5 min；95℃，30 s；61℃，30 s；72℃，1 min；35个循环后72℃，10 min；4℃。PCR产物由上海生工生物工程股份有限进行测序。使用Sequencing Analysis 6和SeqScape v3.0软件进行测序图谱分析和序列比对（参考序列：NG007494）。

结 果

1 Rh表型血清学结果 RhD血型初检为阴性的108例样本中，其中有6例RhD确认试验为阳性，102例为阴性。Rh分型结果共检出ccee 61例、Ccee 37例、CCee 4例、ccEe 3例、CcEe 2例及ccEE 1例，见表1。

表1 RHD血清学及基因分型结果

2RHD基因分型结果 108例样本中，存在不同的等位基因，参见表1。其中67例为RHD*01N.01，23例亚洲型DEL，10例RHD*01N.03型，2例RHD*06.03.01型，3例RHD*15。对于血清学与基因分型结果有疑问的3例标本，进行RHD基因10个外显子测序，结果发现一例RHD*05.03型，在exon5上存在c.667 T＞G 、c.676 G＞C 、c.697 G＞C 、c.712 G＞A突变 ；一例RHD*01N.25，在introne2最后一位碱基发生c.336-1G＞A突变；另发现一例新等位基因，在exon4上存在c.509 T＞G突变，见图1。

图1 一例c.509 T＞G突变测序图

3 意外抗体筛查结果 108例样本中，共计11例样本检出意外抗体，另有2例在注射抗D免疫球蛋白后，短期内进行抗体筛查，检出低效价抗D ，未纳入统计。参见表2。检出的意外抗体均为Rh系统，其中10例为抗D，1例为抗D合并抗C；在多次检测者中，随着孕期增加，抗体由阴转阳或效价有增高趋势。11例个体中，其中9例为RHD*01N.01，1例为RHD*01N.03，1例为RHD*06.03.01。

表2 意外抗体筛查结果

讨 论

中国汉族人群中RhD阴性表型比例较低，约0.4%左右[10]，加上初次妊娠产生抗D抗体几率不大，因此对于RhD-HDFN预防、监测和治疗等并未引起足够重视，常规抗D免疫球蛋白针剂也无法正常获取，但是我国人口基数庞大，RhD阴性围产妇绝对数量并不少，加之目前三胎政策的实施，增大了免疫几率，因此，RhD母胎间同种免疫研究成为围产学及输血医学领域中不容忽视的问题。

本次研究采用商品化试剂盒（PCR-SSP法）进行基因分型研究，在RhD血型初检为阴性108例样本中，发现存在不同的RHD等位基因，最常见的为RHD*01N.01（62.0%，67/108），其次为亚洲型DEL（21.3%，23/108）及RHD*01N.03型（9.3%，10/108）；另检出2例RHD*06.03.01（1.9%，2/108）；3例RHD*15（2.8%，3/108）。结合血清学结果，剩余3例样本可能含有其他或未知的等位基因，不适用该试剂盒，因此采用测序方法，检出1例RHD*05.03型；1例RHD*01N.25型，在introne2最后一位碱基发生c.336-1G＞A突变，该突变位于剪切点位置，可能导致mRNA的正常拼接或拼接效率。另发现一例新的等位基因，在exon4上存在c.509 T＞G突变（Genbank：MW923730），该突变的意义有待进一步研究。由于本研究未进行RH盒子型分析，因此对上述基因分型结果，例如RHD*01N.03、RHD*06.03.01等，并不能明确是纯合突变，还是杂合突变。

正常红细胞表面RhD抗原数量约（1.0～3.3）×104个/红细胞，而Del型低于200个/红细胞[11]，常规血清学检测不出，需要通过吸收放散技术才能检测到。由于吸收放散方法略繁琐，操作不当易产生错误结果；且血清学方法不能明确分子机制，因此本次试验中，直接采用基因检测手段。本次发现的23例亚洲型DEL中，19例为Cc表型，4例为CC表型，均含有RhC抗原。在含有RhC抗原的全部44例个体中（37例Ccee，5例CCee，2 CcEe），52.3%（23/44）的RhC阳性者为亚洲型DEL，与之前报导类似[12-13]，进一步提示RhC抗原可以作为亚洲型DEL的初判标志。

本次研究中，有11例产生了Rh系统抗体，其中10例为抗D，1例为抗DC，未进一步明确该抗体是否为联合抗DC，即抗G。11例个体中，除1名妊娠史不明确外，其余均为多次妊娠者，此外2号曾有输血史；在多次检测者中，发现随着孕期增加，抗体由阴转阳或效价有增高趋势，提示妊娠或输血等免疫史与同种抗D的产生及效价高低呈正相关，RhD阴性孕妇应尽可能避免多次免疫，以防止产生抗D抗体。

产生抗体的11例个体中，有9例为RHD*01N.01，1例为RHD*01N.03，1例为RHD*06.03.01。值得注意的是，23例亚洲型DEL，无一例产生抗D；其余几种基因类型，是否会产生同种免疫性抗D，需增大样本量进一步观察。郭伟等[14]在304名Rh阴性孕产妇中发现29例产生RhD抗体，无一例为亚洲DEL；Wang M等[15]在142名Del表型孕妇中，发现130例为亚洲型DEL，均未产生抗D；剩余的12例中，有6例产生抗体，其基因型为RHD与RHCE外显子发生不同程度的重组交换。亚洲型DEL血型的基因背景为exon9 3' 端最后1位碱基发生c.1227G＞A同义突变，可能影响mRNA的正常拼接或拼接效率，导致RHD基因产物表达程度降低。因此，邵超鹏等[16]认为，亚洲型DEL孕妇妊娠RhD阳性胎儿发生抗D同种免疫反应的可能性很小，这部分个体可免去产前定期抗D筛查及预防性RhD免疫球蛋白的使用。本文的研究结果进一步支持此观点，该理论如果获得推广应用无疑有良好的社会效益。

致谢感谢下列人员对本文血清学实验提供的帮助：郑凌，薛敏，刘太香，冯晨晨，邵雷，张若洋

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突