不同证型膝骨关节炎CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、MMPs-3 表达及相关性研究

江 润，张 涛，段 骏，毛 珍

（武汉市蔡甸区人民医院1.风湿科，2.康复疼痛科，湖北武汉 430000）

膝骨关节炎（KOA）是一种临床常见的关节退行性疾病，好发于老年患者。临床以膝关节疼痛、肿胀，上下楼梯困难等为典型表现，患者严重时常因膝关节肿胀而行动不便［1］。若膝关节疼痛症状不能得到改善，不仅会出现焦虑抑郁等不良情绪，严重影响患者生活质量，还会加速骨质破坏，加速KOA 的进程。当前，临床多根据患者主观症状、影像学表现等明确诊断后，给予相应治疗，鲜少对KOA 患者进行中医辨证分型，实施个体化治疗。研究表明，个体化治疗更符合患者的病情特点，其疗效要明显优于常规疗法［2］，这也是当前研究的热点。骨代谢异常、炎性反应过度为KOA 发病的重要因素，其含量与KOA 患者退化程度密切相关［3］。Ⅰ型胶原蛋白C 末端异物肽（CTX-Ⅰ）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）是反映骨质破坏与吸收的重要标志，存在于破骨细胞中，其含量多少能直接反映骨质重建水平［4］。与传统骨代谢指标相比，其灵感度高，能客观反映体内骨质代谢情况，也是近年来研究的热点。聚蛋白多糖酶-4（ADAMTS-4）和基质金属蛋白酶-3（MMPs-3）作为炎症因子的下游靶点，是促进关节滑膜炎症、关节软骨降解最重要的酶，也是反映关节软骨退变程度的重要标志物。本次研究选取这些最新指标，分析不同证型患者CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、MMPs-3 的含量差异，探究KOA 患者不同证型与骨代谢指标ADAMTS-4、MMPs-3 相关性，为后期精准化治疗提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

从武汉市蔡甸区人民医院康复科纳入98 例诊断为KOA患者。其中阳虚寒凝证40例，女性20例，男性20 例，平均年龄（56.35±3.25）岁，病程（6.01±1.65）年；气滞血瘀证28 例，女性15 例，男性13 例，平均年龄（57.02±1.85）岁，病程（6.92±2.03）年；肾精亏虚证30 例，女性14 例，男性16 例，平均年龄（56.28±2.02）岁，病程（6.35±2.28）年，3 组性别、年龄、病程等比较，差异无明显统计学意义（P＜0.05），具有可比性。

1.2 诊断标准

采用1995 年美国风湿病学会诊断标准［5］：根据患者临床表现，体征及影像学等辅助检查制定：（1）患者有膝关节疼痛病史，并且病程不少于2 个月；（2）膝关节X 线片显示膝关节关节间隙明显变窄，伴或不伴有骨赘增生等；（3）有骨摩擦音或关节活动受限；（4）年龄大于45 岁，晨僵时间不小于30 min；（5）伴或不伴有膝关节骨性膨大。满足以上3 条即可诊断为膝骨性关节炎。

1.3 纳入标准

（1）经过临床检查，结合影像学检测，符合膝骨性关节炎诊断标准；（2）患者均自愿加入本次研究，并签署知情同意书；（3）患者伴有膝关节疼痛、活动受限等症状。

1.4 排除标准

（1）不符合纳入标准者；（2）合并糖尿病、心脑血管疾病、严重肝肾功能损害、恶性肿瘤等疾病者；（3）娠期及哺乳期妇女；（4）既往有膝关节节手术史者；（5）已行膝关节置换术者。

1.5 中医证型诊断标准

参照1994 年《中医病症疗效诊断标准》中医诊断标准［6］。阳虚寒凝证：膝关节疼痛、僵硬、活动不利、遇寒则甚，得温痛减，舌淡、苔白、脉沉细。根据患者主症、舌像、脉像即可诊断。气滞血瘀证：膝关节刺痛，活动不利，疼痛部位固定，面色晦暗，舌暗紫，脉细涩。肾精亏虚证：腰膝酸软，膝关节隐痛，腰膝活动不利，头晕，耳鸣，舌淡红，苔白，脉细。

1.6 研究方法

1.6.1 中医证型分类 本次纳入98 例患者，患者纳入后，根据患者症状、体征等，对患者进行分类，其中阳虚寒凝证40 例，气滞血瘀证28 例，肾精亏虚证30 例。

1.6.2 指标检测 所有患者于空腹抽取静脉血3～5 mL 置于4 ℃恒温冰箱内24 h，3 000 r/min 离心30 min，取上层血清，在-80 ℃冰箱保存待测。采用ELISA 测定CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4 及MMPs-3 含量，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.7 统计学处理

所有数据采用SPSS 22.0 软件进行分析，先采用ShaPiro-Wilk 检验法对数据进行正态性检验，若符合正态分布，采用（±s）表示。多组比较，采用单因素方差分析，若组间有差异，采用Bonferroni 法进行两两比较；若不符合正态分布，选择Kruskal-Wallis 检验；采用Spearman 检验对证型与指标、指标与指标的相关性进行分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中医证型一般资料比较

3 种证型年龄、收缩压、舒张压、BMI 指数等比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同中医证型患者一般资料比较（±s）Tab 1 Comparison of the three TCM syndromes（±s）

表1 不同中医证型患者一般资料比较（±s）Tab 1 Comparison of the three TCM syndromes（±s）

证型阳虚寒凝证气滞血瘀证肾精亏虚证n 40 28 30 FP--年龄（岁）56.35±3.25 57.02±1.85 56.28±2.02 1.650 0.213收缩压（mmHg）134.85±2.31 135.85±2.39 135.63±2.39 1.860 0.200舒张压（mmHg）82.32±2.08 83.02±2.32 82.65±3.25 2.350 0.156 BMI（kg/m2）23.01±1.39 23.65±2.03 23.85±2.39 2.480 0.163病程（年）6.01±1.65 6.92±2.03 6.35±2.28 1.920 0.206

2.2 不同中医证型患者血清CTX-I、TRACP、ADAMTS-4、MMPs-3 含量比较

阳虚寒凝证、气滞血瘀证、肾精亏虚证3 组CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、MMPs-比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与阳虚寒凝证KOA 患者比较，气滞血瘀证、肾精亏虚证患者血清CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、MMPs-3 含量均较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。表明在阳虚寒凝证KOA患者中，CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、MMPs-3 均呈高表达。见表2。

表2 不同中医证型患者血清CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、and MMPs-3 含量比较（pg/mL，±s）Tab 2 Comparison of serum CTX-Ⅰ，TRACP，ADAMTS-4，MMPs-3 levels in patients with different TCM syndromes（pg/mL，±s）

表2 不同中医证型患者血清CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、and MMPs-3 含量比较（pg/mL，±s）Tab 2 Comparison of serum CTX-Ⅰ，TRACP，ADAMTS-4，MMPs-3 levels in patients with different TCM syndromes（pg/mL，±s）

注：与阳虚寒型比较，*P＜0.05。

MMPs-3 179.56±13.65 142.35±16.75*153.24±18.63*14.560 0.003证型阳虚寒凝证气滞血瘀证肾精亏虚证n 40 28 30 FP--CTX-Ⅰ16.35±3.25 12.61±2.86*10.05±2.14*18.320 0.000 TRACP 8.95±1.35 6.25±1.75*4.01±1.63*13.250 0.003 ADAMTS-4 275.68±12.35 243.25±14.56*253.25±18.21*19.300 0.000

2.3 不同证型KOA 与CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、MMPs-3 相关性分析

阳虚寒凝证与CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、MMPs-3 均呈正相关（P＜0.05）；气滞血瘀证与TRACP、ADAMTS-4 呈正相关，与MMPs-3 呈负相关（P＜0.05）；肾精亏虚证与CTX-Ⅰ、ADAMTS-4、MMPs-3 呈现正相关（P＜0.05）。见表3。

表3 不同证型KOA 与CTX-Ⅰ，TRACP，ADAMTS-4，MMPs-3 相关性Tab 3 Correlation of CTX-Ⅰ，TRACP，ADAMTS-4，and MMPs-3 with different syndromes

2.4 骨代谢指标与ADAMTS-4、MMPs-3 相关性分析

CTX-Ⅰ水平与ADAMTS-4、MMPs-3 呈正相关（P＜0.05）；TRACP 水平与 ADAMTS-4、MMPs-3 呈正相关（P＜0.05）。见表4。

表4 骨代谢指标与ADAMTS-4 和MMPs-3 相关性Tab 4 Correlation of bone metabolism indexes with ADAMTS-4 and MMPs-3

3 讨论

3.1 KOA 的临床治疗现状

KOA 是一种临床常见多发的骨关节疾病。KOA 属中医学“痹症”、“骨痹”范畴，本病多因患者年老体虚，肝肾亏虚，筋骨失于濡养；或气机不畅，血脉瘀滞，痹阻经脉；或素体阳虚，不耐诸寒之邪，寒入筋骨，阻滞经络［7］。中医理论将本病分为3 种证型，肾精亏虚证、气滞血瘀证、阳虚寒凝证［8］。辨证论治为中医理论的特点，根据疾病所处病情阶段，给予对症施治，方能从根本上解决问题，这也符合“治病必求于本”的思想精髓。但临床尚缺乏统一的辨证分型标准，临床医者多习惯根据自己经验归纳证型，或缺乏对证型的了解，或不辨证分型，采取统一疗法，诸如此类，从而导致临床上很少有真正意义上的辨证论治。KOA 与骨代谢、炎性反应密切相关［9］。本次研究对KOA 不同证型的发病情况，及与骨代谢、炎性因子水平的相关性进行分析，旨在揭示KOA 不同证型的特点，为后期辨证施治个体化治疗提供客观依据。

3.2 不同证型KOA与CTX-Ⅰ、TRACP的相关性

人体随着年龄的增长，新陈代谢变慢，骨代谢逐渐失衡，骨质破坏大于成骨形成，体内骨量逐渐减少，膝关节附着肌肉组织逐渐老化，软骨变薄或形成骨赘，抵抗能力急剧下降，遇到轻微急慢性损伤，环境变化变容易诱发KOA［10］。不同中医证型的KOA 中，CTX-Ⅰ、TRACP 表达水平存在差异，代李嘉等［11］研究发现，阳虚寒凝型患者CTX-Ⅰ、TRACP 水平明显高于其他中医证型。阳虚寒凝证多为个体阳气虚弱，外感寒邪侵袭，卫阳抗邪无力，寒邪入侵筋骨，经脉痹阻，气血运行不畅，不通则痛，从而导致膝关节疼痛［12］。研究表明［13］，阳虚寒凝型KOA 体内成骨形成较慢，骨破骨水平更高，骨质流失更明显。本次研究发现，阳虚寒凝证、气滞血瘀证、肾精亏虚证三组CTX-Ⅰ、TRACP 含量存在差异（P＜0.05），阳虚寒凝证KOA 患者CTX-Ⅰ、TRACP 含量均高于其他证型，且阳虚寒凝证与CTX-Ⅰ、TRACP 含量呈正相关（P＜0.05）。表明在阳虚寒凝证KOA 体内，骨质破坏更加明显。另肾精亏虚证CTX-Ⅰ、TRACP 水平最低，可能因本证型患者多为老年人群，肾精不足，不能养筋濡骨，自身新陈代谢慢，故骨代谢水平较低。

3.3 不同证型KOA 与ADAMTS-4、MMPs-3 的相关性

ADAMTS-4 一类参与膝关节软骨退化的酶类，同时也是炎症因子（IL-6，TNF-α）的下游靶点［14］。研究表明［15］，当敲除小鼠ADAMTS-4基因，小鼠KOA 发病率显著降低。当关节软骨长期受到机械摩擦，会激活ADAMTS系统，提高ADAMTS-4含量，从而加速软骨破坏。ADAMTS-4 是参与KOA 早期软骨变性的主要酶类［16］。因此调节ADAMT 活性可以作为防治KOA 的新靶点。MMPs-3作为MMPs 家族成员，由软骨细胞分泌，存在于软骨细胞外基质，参与关节软骨的破坏［17］。研究表明［18］。在KOA 不同阶段，关节软骨内的滑膜细胞和软骨细胞存在大量的MMPs，关节软骨的抗应力因此下降，骨代谢异常，诱导软骨细胞发生凋亡，细胞基质加速降解，最终导致关节退变。因此，在KOA 的发病过程中，MMPs-3 是促进关节滑膜炎症、关节软骨降解最重要的酶，也是反映关节软骨退变程度的重要标志物。本次研究结果显示，阳虚寒凝证、气滞血瘀证、肾精亏虚证ADAMTS-4、MMPs-3 含量差异有明显统计学意义（P＜0.05）；阳虚寒凝证ADAMTS-4、MMPs-3 水平最高，且与ADAMTS-4、MMPs-3 含量呈正相关（P＜0.05）。表明阳虚寒凝证KOA 患者ADAMTS-4、MMPs-3含量高，ADAMTS-4、MMPs-3 水平高可能与阳虚寒凝证形成有关。研究表明，骨代谢异常会激活炎症因子介导炎症反应，诱导滑膜细胞、软骨细胞分泌ADAMTS-4、MMPs-3，从而影响蛋白水解酶活性，加速软骨退化［19］. 本次研究表明，CTX-Ⅰ、TRACP 与ADAMTS-4、MMPs-3 均呈正相关（P＜0.05）。表明可以通过检测ADAMTS-4、MMPs-3含量来预估骨代谢水平。

3.4 研究意义与不足

综上所述，不同证型KOA 与CTX-Ⅰ、TRACP、ADAMTS-4、MMPs-3 水平均呈现相关性，且骨代谢指标（CTX-Ⅰ、TRAC）与ADAMTS-4、MMPs-3具有相关性。但是本研究还存在不足之处，本次研究样本量较小，纳入病例特征区域性较明显，难以反映特征群体水平，在今后的研究中，要进行大规模、多中心病例观察研究，各指标在不同证型KOA的作用机制还需进一步研究。

作者贡献度说明：

江润：整个实验的执行者，负责数据的整理，文章的撰写及修改；张涛：对整个实验进行指导；段骏：对整个实验进行指导；毛珍：项目负责人，对整个过程进行指导。