前列腺纤维性增生的差异表达基因筛选及富集研究*

万少平，蔡季，肖靓琨

（1.岳阳市人民医院泌尿外科，湖南岳阳 414000；2.织金县人民医院泌尿外科，贵州织金 552100；3.岳阳市人民医院外科，湖南岳阳 414000）

良性前列腺增生是引起中老年男性排尿障碍最常见的良性疾病之一[1]，随着年龄增长，少数患者会出现尿潴留[1-3]。临床经尿道前列腺电切治疗男性下尿路症状和尿潴留时，发现大多数患者良性前列腺增生是尿道周围腺体的扩大增生，导致排尿困难；显微镜下观察电切前列腺组织，前列腺增生多呈结节性改变，以不同比例间质和腺上皮构成；少数排尿困难的患者，前列腺扩大增生不明显，术中发现前列腺稍增大，甚至变小，呈纤维性收缩，电切组织显微镜下观察组织间质以胶原纤维增生为主，仅见少量增生腺体[4-8]。本研究通过差异基因（differentially expressed genes, DEGs）比较的方法，认识纤维性增生的致病基因，不仅可以深入认识其病理发生的分子本质，为良性前列腺纤维性增生提供基因诊断方法，而且可以指导该类型前列腺增生的治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年2月—2019年12月岳阳市人民医院和织金县人民医院收治的前列腺增生患者14 例，年龄60～91 岁。所有患者出现尿潴留，前列腺特异性抗原＜4 ng/L。入院后行前列腺等离子电切手术治疗，病理诊断为良性前列腺增生，其中纤维性增生7 例（纤维组），结节性增生7 例（结节组）。

所有标本在手术切除后，用生理盐水冲洗3 次，去除血迹，30 min 内放入液氮速冻，置入-80℃冰箱冷冻保存。

1.2 主要试剂及仪器

Trizol RNA 提取试剂盒（美国Invitrogen 公司），Agilent 2100 bioanalyzer（美国Agilent Technologies 公司），六碱基随机引物（深圳华大基因公司），QiaQuick PCR 试剂盒（美国Qiagen 公司），qPCR TaqMan Probe（美国Yeasen 公司）。NanoDrop 分光光度计和Qubit 荧光计（美国赛默飞世尔科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取总RNA标本送深圳华大基因公司，按照Trizol RNA 提取试剂盒说明书进行操作，提取结节性前列腺增生组织及纤维性前列腺增生组织RNA。采用Nanodrop 检测RNA 的纯度（260～280 mm光波处的OD 值），琼脂糖凝胶电泳分析RNA 程度以及是否被污染，Qubit 定量检验RNA 浓度；Agilent 2100 检测RNA 的完整性。

1.3.2 文库制备检测总RNA 样本合格后，采用Oligo（dT）磁珠富集mRNA，将mRNA 打断成短片段模板，用六碱基随机引物合成cDNA 链。cDNA 链经过QiaQuick PCR 试剂盒纯化，洗脱，末端修复，连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳，PCR 扩增富集cDNA，完成文库制备。

1.3.3 测序文库构建完成后，Qubit 2.0 初步定量，Agilent 2100 检测文库的Insert size，qPCR TaqMan Probe 准确定量文库的有效浓度（＞2 nm）。合格后，通过MGIseq-2000测序平台进行PE150测序。

1.4 统计学方法

测序数据采用SOAPnuke（v1.5.2）过滤，过滤后的数据采用Bowtie2（v2.2.5）进行比对，基因相对表达量用RSEM（v1.2.12）计算，用DESeq2（v1.4.5）进行差异基因分析，将校正后的P＜0.05，且差异倍数≥2作为筛选标准。将差异表达基因进行GO 富集分析，用DAVID 工具分析KEGG 信号通路富集情况。

2 结果

2.1 差异基因相对表达量分析

对比两组后发现差异表达基因1 598 个；相较于结节组，纤维组有1 063 个基因相对表达量上调，535 个基因相对表达量下调。见图1。

图1 差异基因相对表达量的火山图

2.2 差异基因的GO富集分析

GO 富集分析将DEGs 分为3 类：生物学过程、分子功能、细胞组分。在生物学过程中，DGEs 主要富集在离子转运、细胞黏附、细胞外基质等生物学过程中（见图2）。在分子功能中，DGEs 主要富集在近端启动子DNA 结合转录激活剂、RNA 聚合酶Ⅱ、DNA 结合转录激活剂、信号受体结合等活性分子功能上（见图3）。在细胞组分中，DGEs主要富集在细胞膜、细胞外区域、质膜等细胞部位（见图4）。

图2 GO富集分析中生物过程组气泡图

图3 GO富集分析中细胞组分组气泡图

图4 GO富集分析中分子功能组气泡图

2.3 差异基因的KEGG通路分析

通过DAVID 工具对DEGs 进行KEGG 信号通路分析后发现，DEGs 主要富集在细胞外基质—受体、细胞因子与细胞因子受体等信号通路上（见图5）。

图5 KEGG富集分析气泡图

2.4 差异基因PPI互作网络分析

将两组样本DEGs 所编码的蛋白质利用String数据库进行PPI 网络互作，预测DEGs 间相互作用，选取PPI 网络中连通度排序前10 位为核心基因并排序。结果为FOS、GNG13、CXCR4、CCL2、OPRM1、PPBP、GAL、OPRK1、JUN、EGR1。对纤维性增生组而言，PPBP、OPRM1、GAL为上调，其余基因均为下调。这些关键基因的关系见图6。

图6 前列腺纤维性与结节性增生关键差异基因的联系

3 讨论

临床良性前列腺结节性增生非常常见，良性前列腺纤维性增生相对较少，本研究从两类患者的基因水平发现其不同，为其发生、发展的作用机制及治疗提供新思路。本研究共发现1 598 个差异表达基因，与结节性增生组织相比，纤维性增生组织中相对表达量上调基因1 063 个，相对表达量下调基因535 个。对这些基因进行GO 富集分析后发现，DGEs 主要富集在离子转运、细胞黏附、细胞外基质组生物学过程，和富集在近端启动子DNA 结合转录激活剂、RNA 聚合酶Ⅱ，信号受体结合等活性分子功能中。KEGG 富集通路分析发现，DEGs 主要富集在细胞外基质—受体相互作用、细胞因子与细胞因子受体相互作用等信号通路上。细胞外基质是由动物细胞合成，并分泌到胞外，分布在细胞表面和细胞之间，是多糖、蛋白质或蛋白聚糖等物质。这些物质不属于任何细胞，但可为细胞生存提供重要的结构支架和组织连接，并通过信号转导系统影响细胞的形态、增殖、分化、迁移、代谢和功能等[9]。

从PPI 互作网络分析可以发现，与纤维性前列腺增生相关的最主要3 个基因为PPBP、OPRM1、GAL。PPBP基因编码的蛋白质是血小板衍生的生长因子，属于趋化因子家族，是中性粒细胞的有效化学吸引剂和活化剂，该蛋白具有杀菌和抗真菌作用，是抗微生物的蛋白质[10-11]。GAL编码的蛋白质在泌尿生殖道广泛表达神经内分泌肽——甘丙肽及其相关肽，其已被证明具有抗真菌活性，并被认为是先天免疫系统的一部分[12-13]。本研究筛选出的PPBP和GAL基因，均可以表达抗菌活性物质，提示前列腺纤维性增生的发生、发展可能与微生物感染有关，至于微生物是细菌或真菌，还未明确。

OPRM1基因位于人类第6 号染色体6q24～q25位置上，长度96.31 kB，包括转录调控区、3 个内含子和4 个外显子。OPRM1通过神经活性配体-受体相关作用，调节雌激素信号通路来调节前列腺的增生[14-16]，OPRM1和上述GAL基因对细胞的增殖为负调控，需要证实的是该负调控可能在前列腺纤维增生过程中的作用机制。

本研究筛选出了3 个与纤维性增生相关的核心差异表达基因，以及若干相关的富集生物位点和生物通路，为临床监测和治疗前列腺纤维性增生提供潜在的生物标志物及靶点。但是本研究病例数不够，可能存在一些偏倚，此外需要进一步完善分子生物学实验来确认这些基因的具体功能。