血清LncRNA PVT1、LncRNA H19表达与前列腺癌患者术后复发转移的关系

陈金玉，张平，孙颖昕，潘敏杰，周珊

（1.南京医科大学附属常州市第二人民医院1.检验科，2.泌尿外科，江苏常州 213000）

前列腺癌是一种严重危害男性生命的恶性肿瘤，随着我国人口老龄化的加剧，前列腺癌患病率逐年上升，已成为我国男性第6 大常见恶性肿瘤[1]。术后复发转移是导致前列腺癌患者生命质量降低和生存期缩短的主要原因，前列腺特异抗原（prostate specific antigen, PSA）是前列腺癌一种肿瘤标志物，但其检测结果易受药物、炎症及良性前列腺病变影响，不能预测前列腺癌复发转移，缺乏相关生物标志物[2]。长链非编码RNA（long noncoding RNA, LncRNA）是一类不编码蛋白质的RNA，可作为癌基因或抑癌基因参与多种肿瘤发生、发展[3]。 浆细胞瘤可变易位基因1（plasmacytoma variant translocation 1, PVT1）和H19 是LncRNA 家族成员。有研究报道，两者在胃癌、卵巢癌、肺癌等恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤细胞的增长、侵袭、迁移和凋亡等密切相关[4-7]。已有研究报道LncRNA PVT1、LncRNA H19 在前列腺癌组织中表达上调[8-9]。但关于两者与前列腺癌术后复发转移的关系尚无研究报道。本研究就检测前列腺癌患者血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 表达，分析两者与前列腺癌患者术后复发转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年5月—2018年5月南京医科大学附属常州市第二人民医院收治的前列腺癌患者169 例作为前列腺癌组。患者年龄42～82 岁，平均（64.57±7.87）岁；病理类型：腺癌141 例，其他类型28 例；根据李志国等[10]研究的分类标准，以肿瘤直径3 cm作为分界点：＞3 cm 84例，≤3 cm 85 例；分化程度：低分化36 例，中高分化133 例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期104 例，Ⅲ期65 例；国际泌尿病理学会修订的Gleason 评分[11]：≥7 分47 例，＜7 分122 例； PSA 为11.89～88.32 ng/ml， 平均49.23（35.64，66.72）ng/ml。纳入标准：①经病理检查确诊为前列腺癌；②初次确诊，未接受任何治疗；③TNM 分期Ⅰ～Ⅲ期；④接受根治性或姑息性手术切除；⑤临床病理资料完整；⑥患者及家属均知情研究，可接受随访。排除标准：①合并其他部位肿瘤者；②严重心、肝、肾等脏器疾病者；③全身感染性疾病者；④血液系统疾病者。另选取同期本院健康体检者74 例作为对照组。研究者年龄27～85 岁，平均（63.87±8.02）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

采集前列腺癌组入院次日清晨和对照组体检时空腹静脉血3 ml，以3 000 r/min 离心10 min，取上清液，置入-80℃冰箱冷冻保存。Trizol 试剂提取总RNA，NanoDrop 2000C 超微量分光光度计验证RNA 浓度和纯度（OD260/OD280 为1.8～2.0），TaKaRa 逆转录试剂盒合成cDNA，进行qRT-PCR 扩增。LncRNA PVT1 正向引物：5'-TTGGCACATACAG CCATCAT-3'，反向引物5'-GCAGTAAAAGGGGAAC ACCA-3'，长度分别为18 bp 和20 bp；LncRNA H19正向引物5'-TACAACCACTGCACTACCTG-3'，反向引物5'-TGGAATGCTTGAAGGCTGCT-3'，长度分别为16 bp、19 bp；内参GAPDH 正向引物5'-GAAGG TGAAGGTCGGAGTC-3'，反向引物5'-GAAGATGGT GATGGGATTTC-3'，长度分别为20、24 bp。反应体系：5.0 μl SYBR Premix Ex Taq，0.2 μl 引物，0.2 μl ROX Reference Dye， 1.0 μl cDNA 模板， 3.4 μl RNase-free ddH2。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s、60℃退火60 s、72℃拉伸60 s，循环45 次，2-ΔΔCt法计算血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 相对表达量。

1.3 随访

前列腺癌患者入院后接受根治性或姑息性手术切除，术后定期行MRI 或组织病理学检查，以电话或门诊方式随访3年，以出现复发转移或末次随访为截止期，截止2021年5月。根据是否复发转移分为复发转移组和未复发转移组，分别有66 例和103 例。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 26.0 统计软件。正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；偏态分布计量资料以中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，比较用Z检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；多因素Cox 回归分析前列腺癌患者术后复发转移影响因素；受试者工作特征（receiver operating characteristic curve, ROC）曲线分析血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 表达对前列腺癌患者术后复发转移的预测价值，并绘制曲线下面积（area under the curve, AUC）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 相对表达量比较

两组血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），前列腺癌组高于对照组。见表1。

表1 两组血清LncRNA PVT1、LncRNA H19相对表达量比较 M（P25,P75）

2.2 复发转移组与未复发转移组临床资料比较

前列腺癌患者术后随访3～36 个月，中位时间22 个月。169 例结肠癌患者截止末次随访术后复发转移66 例，局部复发23 例、远处转移43 例。远处转移患者中骨骼转移27 例、肝转移5 例、肺转移5 例、脑转移2 例、其他部位单发或多发转移4 例。单因素分析显示，复发转移组与未复发转移组TNM 分期、Gleason 评分、PSA、LncRNA PVT1、LncRNA H19 表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），两组年龄、病理类型、肿瘤直径、分化程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 复发转移组与未复发转移组临床资料比较

2.3 前列腺癌患者术后复发转移的多因素Cox 回归分析

以随访时间作为时间变量，TNM 分期（Ⅲ期=1，Ⅰ、Ⅱ期=0）、Gleason 评分（≥7 分=1，＜7 分=0）、PSA、LncRNA PVT1、LncRNA H19 作为自变量，术后是否复发转移作为因变量（是=1，否=0），进行多因素Cox 回归分析，结果显示，TNM 分期Ⅲ期[=3.722（95% CI：1.416，7.784）]、Gleason 评分≥7 分[=4.626（95% CI：1.670，9.815）]、LncRNA PVT1 [=1.982（95 CI：1.521，2.584）]、LncRNA H19[=1.868（95% CI：1.327，2.630）]是前列腺癌患者术后复发转移的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

表3 前列腺癌患者术后复发转移的多因素Cox回归分析参数

2.4 血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 表达单独和联合预测前列腺癌患者术后复发转移的价值

ROC 曲线显示，血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 表达分别单独和联合预测前列腺癌患者术后复发转移的AUC 为0.768 （95% CI： 0.697，0.830）、0.799 （95% CI： 0.730， 0.856）、0.892（95% CI：0.835，0.934），联合预测AUC 大于单独预测。LncRNA PVT1 单独检测的敏感性最高，LncRNA H19 单独检测的特异性最高，联合检测的Youden 指数最高。见表4和图1。

图1 ROC曲线

表4 血清LncRNA PVT1、LncRNA H19表达单独和联合预测前列腺癌患者术后复发转移的价值

3 讨论

前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，2020年全球前列腺癌发病106.6 万例，死亡37.5万例，在48 个国家男性肿瘤致死病因中排第1 位[1]。前列腺癌起病隐匿，早期缺乏典型症状，随着病情进展，可出现尿频、尿不尽、尿不出、尿液或精液带血等症状，往往确诊时已达中晚期，手术切除是前列腺癌主要治疗方式，但大多患者分期较晚，即使经过手术切除，仍有部分患者会出现复发或转移，危害其生命安全。目前临床主要通过临床随访和影像学依据评估前列腺癌术后复发转移，Gleason 评分虽然能较好评估前列腺癌预后，但需要通过穿刺或病理检查进行评价，因此研究列腺癌术后复发转移相关标志物对早期预测复发转移和指导后续治疗具有重要意义。LncRNA 是一类转录本＞200 个核苷酸的非编码RNA，占所有非编码80%，其调控细胞生长、增殖、分化、凋亡等生物学过程，参与肿瘤发生、发展、转移[3]。如LncRNA 同源盒A11 反义RNA 能调节整合素，促进前列腺癌细胞骨转移[12]。

LncRNA PVT1 定位于人染色体8q24.1，进化上高度保守，因人染色体8q24 区是DNA 拷贝数扩增的最高靶点，异常扩增往往与肿瘤发生有关，因此近年来大量研究报道了LncRNA PVT1 与肿瘤的关系。LIU 等[13]研究显示，LncRNA PVT1 在宫颈癌组织中高表达，能通过海绵miR-503 靶向ADP 核糖基化因子样蛋白2 促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭。HU 等[14]研究显示，LncRNA PVT1 在食管癌组织中高表达，能通过海绵miR-128 靶向下调锌指E盒结合同源框1 促进食管癌细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示，前列腺癌组血清LncRNA PVT1 表达显著升高，提示LncRNA PVT1 作为癌基因可能参与前列腺癌的发生，与既往研究报道一致[8]。本研究结果还显示，术后复发转移的前列腺癌患者血清LncRNA PVT1 表达更高，提示LncRNA PVT1 高表达可能与前列腺癌术后复发转移有关。通过Cox 回归也证实了这一点，血清LncRNA PVT1表达每升高1 个单位，术后复发转移几率将增加1.982 倍，其机制可能与LncRNA PVT1 能通过海绵miR-186-5p 靶向上调TWIST 家族bHLH 转录因子1促进前列腺癌上皮细胞-间充质转化有关。上皮细胞-间充质转化是癌细胞增殖、侵袭、转移的重要过程，TWIST 家族bHLH 转录因子1 能通过调控核因子-κB、信号转导和转录激活因子等多种信号通路诱导上皮细胞-间充质转化[15]。CHANG 等[16]研究发现，LncRNA PVT1 能通过海绵miR-186-5p 靶向上调TWIST 家族bHLH 转录因子1 表达，调节上皮细胞-间充质转化，促进前列腺癌细胞增殖、侵袭和转移。

LncRNA H19 定位于人染色体11p15.5，作为一种印迹基因，其印迹异常参与了多种肿瘤发生、发展。如SUN 等[17]研究显示，LncRNA H19 在胃癌组织中高表达，能通过调节miR-519d-3p/乳酸脱氢酶A 轴促进胃癌细胞增殖、有氧糖酵解和免疫逃逸。LAN 等[18]研究显示，LncRNA H19 在甲状腺乳头状癌组织中低表达，能通过抑制肿瘤坏死因子受体2 抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖和迁移。上述研究提示LncRNA H19 在不同肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因作用。本研究结果显示，前列腺癌组血清LncRNA H19 表达显著升高，提示LncRNA H19作为癌基因参与前列腺癌发生。本研究结果还显示，术后复发转移的前列腺癌患者血清LncRNA H19 表达更高，提示LncRNA H19 高表达可能与前列腺癌术后复发转移有关。通过Cox 回归分析表明，LncRNA H19 高表达为术后复发转移独立危险因素，意味着血清LncRNA H19 表达越高术后复发转移几率也就越高，与既往研究报道一致[19]。其机制可能与LncRNA H19 能靶向miR-130-5p 调控人类白细胞抗原G 抑制自然杀伤细胞作用有关。自然杀伤细胞是细胞免疫的主要效应细胞，其杀伤作用降低是肿瘤免疫逃逸后增殖、增殖、侵袭和转移的重要原因[20]。人类白细胞抗原G 能结合自然杀伤细胞抑制其杀伤作用，有研究报道LncRNA H19 能靶向miR-130-5p 上调人类白细胞抗原G 表达，抑制自然杀伤细胞对前列腺癌细胞的杀伤作用[21]。

综上所述，前列腺癌患者血清LncRNA PVT1、LncRNA H19 高表达，为术后复发转移的独立危险因素，可作为前列腺癌患者术后复发转移预测指标。但本研究样本量较少，随访时间较短，关于LncRNA PVT1、LncRNA H19 在前列腺癌患者术后复发转移中的调控机制还需进一步研究。