富马酸二甲酯对肾草酸钙结石大鼠肾功能和氧化应激的影响及其机制研究*

高洁，常相帝，刘益涛，王雅宁，王海婷，董华

（滨州医学院附属医院肾内科，山东滨州 256603）

肾结石是临床常见的并发症及多发疾病，其中肾草酸钙结石是其常见类型，发病率较高，可严重影响患者肾功能。目前，微创手术及体内碎石均是治疗肾草酸钙结石的常用手段，但术后患者常出现较多并发症，且容易复发，因此寻找新的治疗手段抑制结石形成及结石沉积具有重要临床意义[1]。富马酸二甲酯是用于多发性硬化症疾病的基础药物，可激活内源性抗氧化和抗炎通路。肾草酸钙结石发病机制复杂，有研究表明肾脏氧化应激损伤是导致其病情进展的关键因素之一[2]。马志强等[3]研究显示，富马酸二甲酯可以有效降低肾草酸钙结石大鼠草酸钙晶体含量，并抑制大鼠氧化应激损伤。丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）通路是活性氧敏感的信号转导通路之一，其家族成员JNK、p38 与氧化应激反应有关[4]。解斌等[5]研究显示，p38 MAPK 通路能够促进肾小管上皮细胞氧化应激反应，引起肾结石。目前，富马酸二甲酯对肾草酸钙结石大鼠肾功能及氧化应激的改善作用是否与p38 MAPK通路有关的报道较少。因此本研究基于p38 MAPK信号通路探讨富马酸二甲酯对肾草酸钙结石大鼠肾功能及氧化应激的改善作用，以期为临床治疗肾草酸钙结石提供参考。

1 资料与方法

1.1 实验动物

30只SPF级、10周龄SD雄性大鼠，体质量190～240 g，平均（209±25）g，购自北京唯尚立德生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0009；实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）2019-0006。

1.2 主要材料及仪器

富马酸二甲酯（规格5 mg，纯度≥98%）购自深圳海思安生物技术有限公司，核固红染料购自北京伊塔生物科技有限公司，超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase, SOD）活性检测试剂盒、丙二醛（malonaldehyde, MDA）检测试剂盒购自上海莼试生物技术有限公司，活性氧（reactive oxygen species, ROS）测定试剂盒购自上海臻科生物科技有限公司，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色试剂盒购自上海沪震实业有限公司，蛋白提取试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司，兔抗鼠p-JNK、JNK、p38、p-p38 及β-actin 多克隆抗体、山羊抗兔HRP 二抗购自上海钰博生物科技有限公司。Optima™XPN 超速离心机购自美国贝克曼库尔特有限公司，CX31-P 型偏振光光学显微镜购自深圳市博视达光学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及肾草酸钙结石模型的复制将大鼠随机分为对照组、模型组、富马酸二甲酯组，每组10 只。模型组及富马酸二甲酯组大鼠均腹腔注射0.25% L-羟脯氨酸2.5 kg/（kg·d），连续7 d，诱导肾草酸钙结石大鼠模型，尿钙水平升高表明模型复制成功[6]。富马酸二甲酯组大鼠腹腔注射富马酸二甲酯25 mg/（kg·d），连续28 d；对照组、模型组同时腹腔注射等量生理盐水。期间观察大鼠一般情况。

1.3.2 标本采集于最后一次腹腔注射给药前1 d，用代谢笼收集3 组大鼠尿液标本，于最后一次腹腔注射给药后1 h 腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉大鼠，取尾静脉血2 ml，3 000 r/min 离心10 min 后取上清，置入-80℃冰箱冷冻保存，用于检测肾功能指标。3 组大鼠取血完成后处死并取双肾，其中左肾保存于-80℃冰箱待测；右肾用4%多聚甲醛固定，乙醇脱水、透明、石蜡包埋过夜，连续切片约6 μm 厚，用于后续检测。

1.3.3 肾功能指标检测取3 组大鼠尿液及血液，采用全自动生化分析仪检测尿液中尿蛋白、尿钙，以及血液中血肌酐水平，共重复10次[7]。

1.3.4 HE染色取3 组大鼠右肾组织切片，常规脱蜡、水化后行HE 染色，偏振光光学显微镜下观察肾组织草酸钙晶体沉积情况。观察5 个视野中大鼠肾组织肾小管草酸钙晶体形成情况并拍照，统计每个视野草酸钙晶体数量，取平均值，共重复10 次[8]。

1.3.5 大鼠肾组织氧化应激水平检测取3 组大鼠部分左肾组织，制备组织匀浆，3 000 r/min 离心10 min 后取上清，分别采用SOD 活性检测试剂盒、MDA 检测试剂盒及ROS 检测试剂盒检测血清SOD 活性，MDA、ROS水平，共重复10次[9]。

1.3.6 Western bloting检测大鼠肾组织p38 MAPK通路蛋白相对表达量取3 组大鼠剩余左肾组织，制备组织匀浆，3 000 r/min 离心10 min，用RIPA 液冰上裂解，孵育20 min 后3 000 r/min 离心10 min，离心半径8 cm，取上清液测定蛋白总量，取20 μg 上清液与等量上样缓冲液混匀，沸水浴变性，进行电泳、转膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST 清洗，加入p-JNK、JNK、p-p38、p38 及β-actin 作为一抗（1∶500），4℃孵育过夜，TBST 洗涤，加入山羊抗兔二抗（1∶1 000），37℃条件下放置1.5 h 后显影、定影，计算各蛋白相对表达量，共重复10 次[10]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

模型组和富马酸二甲酯组大鼠均成功复制肾草酸钙结石模型。对照组大鼠整体状态良好，皮毛光亮，行动灵活，饮水饮食及大小便均正常；模型组大鼠精神萎靡，皮毛泛黄，慵懒，饮食饮水变少；富马酸二甲酯组大鼠上述一般情况较模型组有一定程度的改善。

2.2 各组大鼠肾功能比较

3 组大鼠尿蛋白、尿钙、血肌酐水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组相比，模型组和富马酸二甲酯组大鼠尿蛋白、尿钙、血肌酐水平升高（P＜0.05）；但富马酸二甲酯组大鼠尿蛋白、尿钙、血肌酐水平低于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肾功能比较 （n=10，±s）

表1 各组大鼠肾功能比较 （n=10，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组富马酸二甲酯组F 值P 值血肌酐/（μmol/ml）10.05±1.56 20.23±3.09①15.79±2.38①②44.286 0.000尿蛋白/（mg/ml）2.06±0.31 12.33±1.90①7.98±1.12①②160.711 0.000尿钙/（mg/ml）0.31±0.05 3.30±0.50①1.97±0.31①②193.124 0.000

2.3 各组大鼠肾组织草酸钙晶体含量比较

对照组大鼠肾小管结构正常，未见草酸钙结晶；模型组大鼠大部分肾小管扩张，可见较多草酸钙结晶；富马酸二甲酯组大鼠部分肾小管扩张，可见草酸钙结晶，但较模型组少。见图1。

模型组、富马酸二甲酯组大鼠肾组织草酸钙晶体含量分别为（71.66±10.75）个和（43.51±6.53）个，经t检验，差异有统计学意义（t=247.172，P=0.000），富马酸二甲酯组较少。

2.4 各组大鼠肾组织氧化应激水平比较

3组大鼠SOD活性，MDA、ROS水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组比较，模型组和富马酸二甲酯组大鼠SOD活性降低，MDA、ROS水平升高（P＜0.05）；但富马酸二甲酯组大鼠SOD 活性高于模型组，MDA、ROS 水平低于模型组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肾组织氧化应激水平比较 （n=10，±s）

表2 各组大鼠肾组织氧化应激水平比较 （n=10，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组富马酸二甲酯组F 值P 值ROS/%67.93±10.20 156.06±23.41①95.77±15.30①②68.706 0.000 SOD/（u/mg）1.37±0.21 0.55±0.09①0.93±0.15①②67.631 0.000 MDA/（nmol/mg）2.67±0.40 9.82±1.47①5.67±0.86①②126.360 0.000

2.5 各组大鼠肾组织p38 MAPK 通路蛋白相对表达量比较

3 组大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组相比，模型组和富马酸二甲酯组大鼠p-JNK、p-p38蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；但富马酸二甲酯组大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相对表达量低于模型组（P＜0.05）。见表3和图2。

表3 各组大鼠肾组织p38 MAPK信号通路蛋白相对表达量比较 （n=10，±s）

表3 各组大鼠肾组织p38 MAPK信号通路蛋白相对表达量比较 （n=10，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组富马酸二甲酯组F 值P 值p-p38 0.45±0.07 1.23±0.19①0.85±0.13①②78.826 0.000 p-JNK 0.37±0.06 1.05±0.16①0.79±0.12①②81.009 0.000

图2 各组大鼠肾组织p38 MAPK信号通路蛋白的表达

3 讨论

肾结石是泌尿系统常见疾病之一，其中肾草酸钙结石发病率较高，患者可出现肾积水及肾盂肾炎，严重情况下导致肾衰竭，且肾结石患者会出现剧痛，给身体健康带来严重危害[11]。近年来，临床多采用微创手术、体外碎石等方式治疗肾结石，但术后易复发且具有较多并发症[12]。富马酸二甲酯是治疗多发性硬化症的新药，其有保护细胞和抗炎作用[13]。徐震等[14]研究显示，富马酸二甲酯可能通过抑制肾脏氧化应激反应，对小鼠肾缺血再灌注损伤发挥保护作用。有报道显示，富马酸二甲酯可抑制肾草酸钙结石的发生、发展[3]。目前，富马酸二甲酯对肾草酸钙结石治疗作用的具体机制尚未明确。

血肌酐升高常表明肾功能受损，而肾功能损伤的关键因素之一是分泌大量尿蛋白[15]。草酸钙晶体是影响尿结石的主要原因之一，对肾脏上皮细胞产生毒性作用[16]。本研究结果表明，富马酸二甲酯对肾草酸钙结石大鼠肾功能有一定改善作用。有研究表明，草酸钙晶体附着的肾小管上皮细胞氧化应激损伤是草酸钙肾结石发生、发展的主要原因之一[17]。正常机体中，氧自由基生成-清除处于平衡状态，病理状态下该平衡被破坏，细胞内SOD 活性降低，使ROS 升高，破坏细胞结构，生成大量MDA，检测细胞外SOD 活性和MDA 水平可以反映细胞氧化应激损伤程度[18]。赵明等[19]研究显示，抑制肾组织氧化应激反应能够抑制肾草酸钙结石形成进展。本研究结果显示，与对照组比较，模型组和富马酸二甲酯组大鼠SOD 活性降低，MDA、ROS 水平升高；但富马酸二甲酯组大鼠SOD活性高于模型组，MDA、ROS 水平低于模型组，说明富马酸二甲酯可能通过抑制肾组织氧化应激反应，抑制肾草酸钙结石形成进展。

MAPK 通路是一种氧化应激转导通路，通常由JNK、p38 通路及细胞外信号调节激酶等通路组成[20]。王博涵等[21]研究显示，抑制p38 MAPK 通路活化可有效抑制肾小管上皮细胞氧化应激损伤，进而抑制黏附性尿石形成。本研究结果显示，与对照组比较，模型组和富马酸二甲酯组大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相对表达量升高；但富马酸二甲酯组大鼠p-JNK、p-p38 蛋白相对表达量低于模型组，与既往研究结果一致[20-21]。

综上所述，富马酸二甲酯可能通过抑制p38 MAPK 通路活化，抑制肾脏组织氧化应激反应，从而抑制肾草酸钙结石形成，进而保护肾功能。而本研究并未能明确富马酸二甲酯对p38 MAPK 通路的具体调控作用，有待后期深入研究。