靶向铁死亡信号通路抗肿瘤天然产物的研究进展

冯嘉润，詹 盛，许焕丽

（首都医科大学 基础医学院，北京 100069）

铁死亡是一种铁依赖性的细胞中脂质活性氧异常累积造成的细胞程序性死亡。铁死亡有别于凋亡、自噬及坏死等经典的细胞死亡方式，其无法被凋亡抑制剂所抑制，却能被铁螯合剂或摄入的铁抑制剂所阻断。铁死亡参与了多种肿瘤的发生及耐药性产生。大量研究证明，通过诱导肿瘤细胞铁死亡可有效抑制肿瘤生长，为新的抗肿瘤药物的开发及克服肿瘤耐药带来希望[1]。

许多化疗药物均可通过多种途径介导细胞凋亡来杀死肿瘤细胞，然而，由于肿瘤细胞对凋亡获得性的、内在的抵抗，仅通过诱导凋亡抗肿瘤的效果有限。因此，通过诱导其他形式的非凋亡性的细胞死亡方式来杀伤肿瘤细胞、抵抗肿瘤耐药有望成为肿瘤治疗的新的有效手段。天然产物是发现抗肿瘤药物先导化合物的重要资源。近年研究表明，许多天然药物可通过调控肿瘤细胞铁死亡发挥抗肿瘤作用。因此，本文重点对铁死亡通路上的相关靶点及天然产物对其干预的机制进行综述，为其进一步研究、开发和临床应用提供理论参考。

1 铁死亡信号通路与肿瘤的治疗

铁死亡是由于细胞抗氧化能力降低，二价铁离子以类似芬顿反应的方式氧化脂质产生大量活性氧簇，达到一定程度所引起的细胞氧化性死亡。细胞抗氧化能力降低主要是由于谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）失活导致的。在还原型谷胱甘肽（GSH）存在的情况下，GPX4将过氧化氢和有毒的脂质过氧化物分解成水或相应的无毒脂质醇。位于细胞膜上的胱氨酸-谷氨酸反向转运体（System Xc-）可以1:1的比例转出谷氨酸，同时转入胱氨酸，在氨基酸的转运中起十分重要的作用。胱氨酸在摄入后迅速被还原为半胱氨酸，然后参与GSH的合成，维持细胞的氧化还原稳态[2]。因此，GPX4活性是调控铁死亡的枢纽与核心。

二价铁离子的存在也是铁死亡的必要条件。膜蛋白转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）可转运Fe3+进入细胞，在二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）作用下转为Fe2+。铁反应元件结合蛋白2（iron responsive element binding protein 2，IREB2）、核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2）可调控细胞内Fe2+[2]。铁死亡受到细胞中多种代谢的严密调控，如氨基酸代谢、脂质代谢、铁代谢等。针对以上途径进行调控可诱导或抑制铁死亡的发生。

近年越来越多的研究表明，诱导肿瘤细胞铁死亡与抑制肿瘤的生长、转移及耐药密切相关[3-4]，诱导铁死亡从而有效地靶向癌细胞已成为当今药物开发的热点。

2 靶向System Xc- 的天然产物

System Xc-由两个亚基组成，包括轻链亚基SLC7A11和重链亚基SLC3A2[5]。SLC7A11负责System Xc-的主要活性，而SLC3A2主要发挥辅助协调作用，目前关于铁死亡的研究主要集中于对SLC7A11的调控方面。研究表明[6-7]，许多恶性肿瘤如肝细胞癌、非小细胞肺癌细胞膜上的SLC7A11的表达量明显上调，以维持高水平的GSH含量，应对氧化还原应激状态。GSH是GPX4激活的必要辅因子，因此通过抑制System Xc-间接抑制GPX4的活性已被证明是有效的诱导肿瘤细胞铁死亡的方法[8-9]。

丹参酮IIA是从中药丹参中提取的具有抗肿瘤活性的脂溶性菲醌化合物[10]。Guan等[11]研究发现，丹参酮IIA可诱导BGC-823和NCI-H87胃癌细胞中p53蛋白的表达上调，而p53蛋白可结合SLC7A11的启动子区，抑制其转录，进而诱发铁死亡，抑制胃癌细胞的增殖。

3 靶向GPX4的天然产物

GPX4可去除细胞中的脂质活性氧（reactive oxygen species，ROS），是铁死亡中的关键调节因子。典型的铁死亡诱导剂ras选择性致死化合物（ras selective lethal compound 3，RSL3）就是通过共价结合GPX4中硒代半胱氨酸的活性位点，抑制GPX4的活性，造成细胞内脂质过氧化物积累和铁死亡[12]。靶向GPX4诱导铁死亡已成为抗肿瘤药物开发的重要策略。

没食子酸（gallic acid，GA）是从植物中分离得到的天然酚类化合物，可有效治疗胃癌、宫颈癌、乳腺癌和黑色素瘤等癌症[13]。Khorsandi等[14]研究发现，低水平激光联合GA可通过细胞凋亡和铁死亡机制诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞死亡。单独GA处理的乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖活性无显著降低，而GA联合低水平激光处理的MDAMB-231细胞内ROS水平升高，GPX4及细胞增殖活性降低。

异硫氧酸盐是来源于十字花科植物中的一类具有抗肿瘤活性的有机化合物，其中苯乙基异硫氧酸盐（phenethyl isothiocyanate，PEITC）是一种ROS诱导剂[15-16]，有望发展为抗肿瘤治疗药物。大多数研究报道PEITC能诱导多种肿瘤凋亡[17-18]，而Lv等指出PEITC在人骨肉瘤细胞中可诱导多种方式的细胞死亡，包括铁死亡[19]。PEITC降低了GSH/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）比值，同时抑制GPX4的表达，导致ROS的积累，细胞发生铁死亡。该研究还检测到TFR1的高表达，铁蛋白重链（ferritin heavy chain 1，FTH1）和膜铁转运蛋白（ferroportin，FPN）的表达下降，导致细胞内铁含量升高，诱导铁死亡的发生[19]。

澳洲茄碱是一种提取自龙葵的生物碱，具有多重药理作用，如促进神经发生、促进氧化活性、抑制真菌感染等[20]，亦有抑制肿瘤细胞生长的作用[21-22]。Jin等[23]研究发现，澳洲茄碱可诱导谷胱甘肽氧化还原系统破坏，促进肝癌细胞HepG2细胞的铁死亡作用。澳洲茄碱通过抑制谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS），间接抑制了GPX4的活性，提高了HepG2细胞脂质ROS水平，参与了肝细胞癌HepG2细胞的铁死亡过程。

另外，丹参活性成分隐丹参酮能剂量依赖性抑制肺癌A549细胞的增殖，其机制与增加热休克蛋白B1（heat shock protein B 1，HSPB1）和GPX4的mRNA表达水平，进而诱导铁死亡有关[24]。

4 靶向GSH的合成或消耗的天然产物

GSH在维持和调控细胞内氧化还原环境中发挥着重要作用。除了System Xc-和GPX4可影响GSH合成外，谷胱甘肽的合成与消耗还受其他因素，如谷氨酰胺分解抑制、半胱氨酸利用率降低和胞外高浓度的谷氨酸等的影响[2]。一些天然产物可作用于GSH的合成或消耗从而诱导铁死亡。

青蒿素是从中药青蒿（Artemisia annuaL.）中提取的一种天然化合物，青蒿素及其衍生物包括青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿甲醚和蒿醚，已被用于多药耐药疟疾的治疗[25]。近年，青蒿素及其衍生物作为铁死亡诱导剂的相关研究日益增加，它们主要通过消耗GSH、增加ROS水平，并影响铁的代谢等多个方面来调控铁死亡的发生。

青蒿琥酯是一种水溶性的青蒿素衍生物，除抗疟作用外，还具有抗癌活性[26]。Eling等[27]检测到青蒿琥酯作用下胰腺导管腺癌（PDAC）细胞ROS水平上升，并证实青蒿琥酯可诱导PDAC细胞发生铁死亡。Greenshields等[28]发现，青蒿琥酯对卵巢癌细胞的细胞毒性效果是依赖于ROS的，且外源性铁的使用可提高青蒿琥酯治疗卵巢癌的有效性，青蒿琥酯可诱导卵巢癌细胞铁死亡。

双氢青蒿素是一种青蒿素活性产物，除了具有传统的抗疟疾作用外，还对多种癌症显示出良好的抗肿瘤效果[29-30]。李艳纯等[31]检测到双氢青蒿素处理后肝癌细胞内ROS水平上升，同时伴随细胞内GSH水平下降及GPX4蛋白表达的下调。因此双氢青蒿素对肝癌细胞的增殖抑制作用机制可能不仅局限于之前发现的细胞凋亡，铁死亡可能在其中也发挥了作用。亦有研究发现，双氢青蒿素可降低DNA引物酶M2（DNA primase M2，PRIM2）的表达。PRIM2是DNA引物酶的亚基，参与调控DNA复制。PRIM2的缺失可导致SLC7A11表达的下调，诱发铁死亡，抑制肺癌细胞的增殖[32]。Lin等发现双氢青蒿素可诱导头颈部癌（HNC）细胞铁死亡和凋亡[33]。因此，通过双氢青蒿素诱导铁死亡可能成为多种癌症治疗的一种新方法。

5 靶向脂质ROS堆积的天然产物

脂质过氧化代谢紊乱导致的ROS堆积为铁死亡的另一个重要影响因素。细胞膜中脂质中的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）经一系列反应产生的过氧化物是ROS的来源，积累的ROS可进一步参与生物膜的氧化过程。这些自由基可从邻近的PUFA中转移质子，引发新一轮的脂质氧化，使氧化损伤扩散，进而加速ROS的产生。过多的ROS积累会导致铁死亡的发生[3]。脂质的过氧化过程通过增加脂质毒性在诱导铁死亡中发挥重要作用，所以通过调节脂质代谢增加ROS的水平也为诱导细胞铁死亡提供了思路。

荜茇是胡椒科胡椒属植物荜茇的干燥未成熟或成熟果穗，有效成分包括酰胺类、萜类、甾醇类、挥发油类等，其中荜茇酰胺为主要特征性成分。最新的研究表明荜茇酰胺有抗肿瘤、降脂、抗菌和抗氧化等方面的功效[34]。荜茇酰胺直接结合并抑制细胞中的抗氧化酶谷胱甘肽S-转移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1），导致肿瘤细胞内ROS水平升高，但对正常细胞没有毒性[35]。Yamaguchi等[36]研究发现，荜茇酰胺可诱发胰腺癌细胞内GSH水平下降，ROS水平升高，进而发生铁死亡。同时研究提示子叶列宁a（cotylenin A，CNA）、柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine，SSZ）与荜茇酰胺联合使用可增加细胞中ROS的产生，3种药物联合治疗胰腺癌疗效显著。亦有研究发现，荜茇酰胺对胃癌细胞增殖有抑制作用，其机制与荜茇酰胺可诱导胃癌细胞中ROS的形成有关。荜茇酰胺下调铁死亡关键蛋白GPX4、System Xc-的表达，进而诱导铁死亡的发生[37]。因此，荜茇酰胺是一种很有潜力应用于癌症治疗的药物。

6 靶向Nrf2的天然产物

Nrf2是调控细胞氧化应激的核心转录因子，具有强大的抗氧化/抗凋亡作用，是肿瘤细胞耐药的重要机制。在氧化应激时，Nrf2会与Kelch样ECH关联蛋白1（Kelchlike ECH associated protein 1，KEAP1）解离，转位进入细胞核，与受其调控的抗氧化酶基因的抗氧化反应元件结合，Nrf2的靶基因表达产物包括血红素加氧酶1（hemeoxygenase-1，HMOX1），SLC7A11和GPX4 等。

葫芦巴碱是一种大量存在于咖啡和葫芦巴种子的生物碱，具有多重药理作用[38]。研究表明，葫芦巴碱在体外和体内都可逆转RSL3诱导的头颈癌细胞（HNC）对铁死亡的抗性[39]。其机制与抑制Nrf2的转录活性有关。葫芦巴碱可通过抑制Nrf2下调HMOX1和FTH1基因水平，从而改变铁代谢和脂质过氧化作用，获得铁死亡抗性。另一方面，葫芦巴碱还阻断了金属硫蛋白 1G（metallothionein-1G，MT-1G）的表达，使GSH含量降低，进而诱导铁死亡。此外，葫芦巴碱还可通过克服铁死亡抗性，增强胰腺癌对依托泊苷的敏感性[40]及肝癌对索拉菲尼的敏感性[41]。

然而，在另一项研究中Nrf2及HMOX1的上调被证明抑制了铁死亡的发生。醉茄素A是从南非醉茄中分离的甾体内脂，具有抗炎、抗肿瘤等功效。其在中剂量下可靶向作用于KEAP1，激活Nrf2，上调HMOX1的表达，进而诱导神经母细胞瘤的铁死亡。这一现象可由HMOX1水平对细胞毒性的两面性解释：中等水平的HMOX1对细胞具有保护作用；而HMOX1的过表达可导致细胞中不稳定Fe2+增加，诱导铁死亡。因此，使HMOX1过量表达或抑制HMOX1的表达均可诱导铁死亡的发生。此外，醉茄素A在高剂量下，可直接使GPX4失活，从而使细胞对铁死亡敏感[42-43]。

7 靶向铁离子积累

铁死亡中铁的存在是必要的。细胞内铁离子浓度的上升可促进铁死亡的发生[44]，而使用铁螯合剂如去铁胺则可抑制细胞的铁死亡[45]。然而，铁在铁死亡中发挥的具体作用仍存在争议。一种可能的解释为铁可向氧化物提供电子，促进ROS的形成，而铁螯合剂阻断铁死亡的机制是它们阻止了铁提供电子[46]。

鲁斯可皂苷元是一种从生长在地中海地区的假叶树（Ruscus aculeatusL.）中分离得到的一种甾体皂苷元，也是常用中药麦冬中的主要皂苷元[47]。鲁斯可皂苷元具有多种药理活性，用于治疗多种炎症、心血管疾病及癌症[47-48]。Song等研究了鲁斯可皂苷元在胰腺癌中的作用，发现鲁斯可皂苷元能显著抑制胰腺癌细胞的存活。鲁斯可皂苷元通过上调转铁蛋白（transferrin，TF）表达和下调FPN表达增加了细胞内铁离子的浓度，同时增加了ROS的产生，促进了胰腺癌细胞的铁死亡[49]。

β-榄香烯是从姜黄中分离出的一种生物活性化合物，具有抗癌作用，可用于多种癌症治疗[50]。Chen等[51]首次证实了KRAS突变型结直肠癌细胞对β-榄香烯和西妥昔单抗联合治疗敏感，二者联合诱导KRAS突变结直肠癌细胞HCT116铁死亡。β-榄香烯联合西妥昔单抗处理后，HMOX1和TF的表达明显升高，而使用去铁胺几乎可完全逆转细胞的死亡。HMOX1是细胞内铁离子的重要来源，该研究证明β-榄香烯通过调节胞内铁的浓度促进了铁死亡的发生。同时，铁死亡负调控蛋白，包括SLC7A11、GPX4、FTH1、谷氨酰胺酶和SLC40A1的表达显著降低。该研究表明，β-榄香烯和西妥昔单抗可联合诱导铁死亡，有望为KRAS突变的结直肠癌患者提供一种治疗策略。

图1 天然药物调控肿瘤细胞铁死亡机制

8 总结与展望

铁死亡是一种区别于凋亡的新型细胞死亡方式。已有多个证据表明铁死亡在肿瘤细胞的生长调控和耐药等方面发挥着重要作用，可作为新的抗肿瘤靶标。铁死亡调控主要通过3种代谢途径实现：氨基酸代谢，包括胱氨酸转入，GSH合成，最终影响GPX4的活性；脂质代谢，包括从PUFA到脂质ROS的氧化途径；铁代谢，如FPN，TFR1，HMOX1等调节细胞内二价铁离子浓度。本文所涉及的天然药物主要从上述方面调控了铁死亡。在应用方面，诱导铁死亡能提高化疗药物的疗效，如文中所述葫芦巴碱联合依托泊苷治疗胰腺癌等。另外，利用铁死亡对抗一些癌症细胞产生的化疗耐药性也是研究关注的一个焦点[4]。

越来越多的研究表明，具有抗肿瘤作用的天然产物除了参与细胞凋亡、坏死、自噬等细胞死亡方式外，还可诱导铁死亡。这些药物通过不同的细胞死亡机制发挥抗肿瘤作用，但是它们所诱导的凋亡、坏死、自噬和铁死亡之间的具体联系还有待探究。研究药物调控不同细胞死亡方式之间的关系可能对联合用药及更好地发挥药物作用有所帮助。目前，铁死亡中很多具体机制是不明确的，进一步研究铁死亡的具体机制会更有助于诱导铁死亡新药的研发。

天然来源的化合物是抗肿瘤药物的重要来源。我国中药资源丰富，其中含多种调节铁死亡的活性成分，且与经典铁死亡诱导剂或抑制剂相比，具有价廉、来源广、疗效可靠等优势，进一步发掘可诱导铁死亡的天然药物具有重要意义。