不同来源灵芝孢子粉多指标质量评价

常馨月，刘 阳，胡美赓，米 晓，俞 月，路 娟，陈 曦，赵 丹，丁自勉*

（1. 中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193；2. 安徽省衡济堂健康科技有限公司，安徽 六安 242232）

灵芝（Ganoderma lucidum）是担子菌纲、多孔菌科、灵芝属（Ganoderma karst）真菌[1]，国内目前现有赤芝、黄芝、紫芝、黑芝、松杉灵芝和树舌灵芝等20多种灵芝种类，2020版《中华人民共和国药典》收入作为药材灵芝来源的是赤芝[Ganoderma lucidum(Leyss. ex Fr.) Karst.]或紫芝（Ganoderma sinenseZhao, Xu et Zhang）的干燥子实体。

灵芝早在《神农本草经》中就被列为上品，现作为常用药用真菌，其性温、味甘，有补中益气、滋外强壮、扶正固本之功效，主治虚劳、咳嗽、气喘、失眠、消化不良。临床用于治疗慢性气管炎、支气管哮喘、白细胞减少症、冠心病、心律失常、急性传染性肝炎等疾病[2]。由于灵芝的种类繁多，其活性成分易受多种因素的影响，使其广泛应用受到限制。此外，目前对灵芝的研究主要针对其活性成分[3]，但重金属的残存会对于药材的药效乃至安全性产生很大影响。灵芝成熟期后，菌盖中形成的种子名为灵芝孢子（Ganoderma lucidumspore），具有灵芝的全部活性物质[4]。本文根据现有标准[5-6]，以灵芝孢子粉中多糖、三萜及甾醇、重金属含量为指标对灵芝进行综合质量评价，为灵芝孢子粉后续研发生产提供支持[7-8]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent Cary 100型变温紫外分光光度计（美国Agilent Technologies公司）；Agilent 7700X电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent Technologies公司）；2-16R台式高速微量冷冻离心机（上海托莫斯）；HH-S6A电热恒温水浴锅（北京科伟永兴）；超声波清洗机（宁波新芝）；AB265-S电子分析天平（梅特勒-托利多）。

1.2 试剂与试药

桑树树种灵芝孢子粉，白杨树树种灵芝孢子粉，橡树树种灵芝孢子粉，黄栗树树种灵芝孢子粉，桦树树种灵芝孢子粉，赤芝一号灵芝孢子粉，分别于2019年7月20日～30日，7月31日～8月9日，8月10日～20日，8月21日～9月5日，9月6日～25日采收，均由霍山县中土灵芝专业合作社提供；无水葡萄糖对照品，齐墩果酸对照品（上海融禾）；铅、砷、镉、镍、铬、锗、铑单元素标准液（国家有色金属及电子材料分析测试中心）；香草醛，硫酸（AR），蒽酮（AR），冰醋酸（AR），无水乙醇（AR），甲醇（AR），高氯酸（GR），硝酸（GR），过氧化氢（GR），乙酸乙酯（天津市福晨化学试剂厂）；高纯度蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 多糖含量（以无水葡萄糖计）测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定无水葡萄糖对照品3.00 mg，置于25 ml量瓶中，加水定容至刻度，即得0.12 mg/ml葡萄糖对照品溶液。

2.1.2 标准曲线的绘制[9]精密量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml，分别置10 ml具塞试管中，各加水至2.0 ml，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蔥酮0.1 g，加硫酸100 ml溶解，摇匀）6 ml，立即摇匀，放置15 min后，立即置冰浴中冷却15 min，取出，以相应试剂为空白，在625 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。得标准曲线为Y=4.1442X+0.1698，R2=0.9964，说明在0.024～0.144 mg/ml浓度范围内，吸光度与浓度呈良好线性关系。

2.1.3 供试品溶液的制备 取分期采集的白杨树树种、橡树树种、黄栗树树种、桦树树种、及赤芝一号灵芝孢子粉各约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水60 ml，静置1 h，加热回流4 h，趁热滤过后用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60 ml，加热回流3 h，趁热滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用蒸馏水5 ml溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75 ml，摇匀，4 ℃放置12 h，离心，弃去上清，沉淀物用热水溶解并转移至50 ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心，精密量取上清3 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 测定法 精密量取供试品溶液2 ml，置10 ml具塞试管中，照2.1.2项下方法自“迅速精密加入硫酸蔥酮溶液6 ml”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品中葡萄糖的含量，计算，即得。

2.1.5 精密度、重复性及稳定性试验 精密吸取葡萄糖对照品溶液2 ml，按2.1.2项方法显色后测定吸光度，连续测定5次，计算得吸光度的RSD为0.11 %（n=5），表明仪器精密度良好。精密称取同一批次灵芝孢子粉6份，按2.1.3项方法制备供试品溶液，分别精密吸取6份供试品溶液、葡萄糖对照品溶液各2 ml，按2.1.2项方法显色后测定吸光度，计算得供试品中灵芝中无水葡萄糖含量和对照品中无水葡萄糖含量的RSD分别为0.68 %，0.55 %（n=6），表明方法重复性良好。精密吸取灵芝孢子粉供试品溶液、葡萄糖对照品溶液各2 ml，按2.1.2项方法显色后，分别于0，10，20，30，40，50，60 min测定吸光度，计算得灵芝中无水葡萄糖含量RSD为0.37 %，表明该方法显色在60 min内稳定。

2.1.6 加样回收试验 精密称取已知多糖含量（10.50 mg/g）的灵芝孢子粉9份，每份约1 g，精密称定，共分为3组，每组3份。分别加入0.12 mg/ml葡萄糖对照品溶液26.25，43.75，61.25 ml，使供试品溶液中多糖浓度水平为80 %，100 %，120 %，按2.1.3项方法制备供试品溶液，精密吸取2 ml供试品溶液，置具塞试管中，按2.1.2项方法显色后测定吸光度，计算加样回收率，平均加样回收率为98.39 %，RSD为1.01 %，表明该方法准确度较高。

2.1.7 灵芝多糖含量测定 取不同采收期及不同树种灵芝孢子粉，按2.1.3项方法制备供试品溶液，按2.1.2项方法显色，在625 nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中葡萄糖含量，结果见表1。

表1 多糖、三萜及甾醇含量测定结果（n=10）

2.2 三萜及甾醇的测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定齐墩果酸对照品2.00 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得0.2 mg/ml齐墩果酸对照品溶液。

2.2.2 标准曲线的绘制[9]精密量取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 ml，分别置15 ml具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密称取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 ml，即得）0.2 ml、高氯酸0.8 ml，摇匀，70 ℃水浴加热15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 ml，摇匀，以相应试剂为空白，在546 mm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。得标准曲线为Y=12.437X-0.0402，R2=0.9991，说明在0.02～0.10 mg/ml浓度范围内，吸光度与浓度呈良好线性关系。

2.2.3 供试品溶液的制备 取供试品粉末各约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇50 ml，超声（功率140 W，频率42 kHz）处理45 min，滤过，滤液置100 ml量瓶中，用适量乙醇分次洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 测定法 精密量取供试品溶液0.2 ml，置15 ml具塞试管中，照2.2.2项下方法，自“挥干”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，计算，即得。

2.2.5 精密度、重复性及稳定性试验 精密吸取齐墩果酸对照品溶液溶液0.2 ml，按2.2.2项方法显色后测定吸光度，连续测定5次，计算得吸光度的RSD为0.13 %（n=5），表明仪器精密度良好。精密称取同一批次来源6份灵芝孢子粉约2 g，按2.2.3项方法制备供试品溶液，分别精密吸取6份供试品溶液、齐墩果酸对照品溶液0.2 ml，按2.2.2项方法显色后测定吸光度，计算得供试品中灵芝三萜及甾醇含量和对照品含量的RSD分别为0.44 %，0.83 %（n=6），表明方法重复性良好。精密吸取灵芝孢子粉供试品溶液、齐墩果酸对照品溶液0.2 ml，按2.2.2项方法显色后，分别于0，10，20，30，40，50，60 min时测定吸光度，计算得灵芝三萜及甾醇含量的RSD分别为0.22 %，表明该方法显色在60 min内稳定。

2.2.6 加样回收试验 精密称取已知三萜及甾醇含量（30.45 mg/g）的灵芝孢子粉供试品9份，每份约1 g，精密称定，共分为3组，每组3份。分别加入0.2 mg/ml齐墩果酸对照品溶液45.675，76.125，106.575 ml，使供试品溶液中三萜及甾醇浓度水平为80 %，100 %，120 %。按2.2.3项方法制备供试品溶液，精密吸取0.1 ml供试品溶液，置具塞试管中，按2.2.2项方法显色后测定吸光度，计算加样回收率，平均加样回收率为98.39 %，RSD为1.01 %，表明该方法准确度较高。

2.2.7 三萜及甾醇含量测定 取不同采收期及不同树种灵芝孢子粉，按2.2.3项方法制备供试品溶液，按2.2.2项方法显色，在546 nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量即得灵芝孢子粉供试品内三萜及甾醇含量，结果见表1。

2.3 重金属含量测定

2.3.1 参考标准 重金属总量按中华人民共和国药典2020版（一部）附录IXE重金属检测方法[10]检测；各重金属元素含量参考2015年国际标准《中医药-中药材 重金属限量》中电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[11]检测。

2.3.2 ICP-MS测定条件及数据采样模式 等离子气流量：15.0 L/min；蠕动泵转速：0.20 r/s；雾化室温度：2 ℃；辅助气流量：0.8 L/min；He气流量：5 ml/min；载气流量：0.8 L/min；射频功率：1550 W；跳峰采集；采样深度：10 mm；重复次数：3次；扫描次数：100次。

2.3.3 对照品溶液的制备

2.3.3.1 铬、镍、铅、砷、镉标准储备液的制备 分别精密量取铅、砷、镉、镍、铬单元素标准溶液适量，用10 %硝酸溶液稀释，制成浓度分别为每1 ml含1，0.5，1，1，10 μg的标准储备液。

2.3.3.2 内标溶液的制备 精密量取锗、铑单元素标准溶液适量，用水稀释，制成每1 ml各含1 μg的混合内标溶液。

2.3.4 标准曲线的绘制 精密量取铬、镍、铅、砷、镉标准储备液适量，用10 %硝酸溶液稀释制成每1 ml分别含铅、砷0，1，5，10，20 ng，含镉0，0.5，2.5，5，10 ng，含铬0，2.00，4.00，8.00，12.00，16.00 ng，含镍0，50，100，200，500 ng的混合标准溶液，即得。铬、镉、铅测定以锗为内标，镍、砷测定以铑为内标，进样测定。以浓度为横坐标X，以待测元素与内标元素的信号值之比为纵坐标Y，绘制标准曲线，结果见表2。由表2可见，5种重金属元素标准曲线线性相关系数均接近1，说明在重金属检测线性范围内，待测元素与内标元素的信号值与浓度呈良好线性关系。

表2 重金属标准曲线及检出限、定量限

2.3.5 定量限及检出限 对10 %硝酸溶液和样品的消解试剂“5 ml硝酸溶液+3 ml过氧化氢溶液”空白连续测定11次，计算每种元素响应值的标准偏差（SD），取测定结果的3倍SD为相应元素的检出限，10倍SD为方法定量限，结果见表2。各种元素的仪器检出限范围在0.0002～0.0185 ppb之间，方法检出限在0.0024～0.0703 ppb之间，说明该方法的灵敏度能满足测定要求。

2.3.6 供试品溶液的制备 精确称取样品0.2500 g，置聚四氟乙烯消解罐中，加入5 ml硝酸静置一段时间，放入消煮炉内100 ℃（每分钟上升5 ℃）消煮，直至样品消煮完全，再加入3 ml过氧化氢，100 ℃赶酸，直至消煮液余量低于2 ml，然后转移至50 ml量瓶内，定容。同法制备空白试剂溶液。

2.3.7 测定法 精密量取内标溶液与供试品溶液各10 μl，注入电感耦合等离子体质谱仪，按2.3.4项下方法测定响应值，按峰高读数，按标准曲线计算供试品溶液中重金属的含量。

2.3.8 精密度、重复性及稳定性试验 精密称取一批次灵芝孢子粉，按2.3.6项方法制备供试品溶液，按2.3.4项方法连续测定6次，计算得供试品溶液中铬、镍、铅、砷、镉元素含量的RSD分别为0.17 %，0.41 %，0.63 %，0.05 %，0.13 %（n=6），表明仪器精密度良好。精密称取同一批次来源灵芝孢子粉6份，按2.3.6项方法平行制备6份供试品溶液，按2.3.4项方法测定，计算得供试品溶液中铬、镍、铅、砷、镉元素含量的RSD分别为0.25 %、0.51 %，0.62 %，0.13 %，0.10 %（n=6），表明该方法重复性良好。精密称取一批次灵芝孢子粉，按2.3.6项方法制备供试品溶液，按2.3.4项方法于0，10，20，30，40，50，60 min测定，计算得供试品溶液中铬、镍、铅、砷、镉元素含量的RSD分别为0.13 %，0.28 %，0.40 %，0.07 %，0.10 %，表明检测在60 min内稳定。

2.3.9 加样回收试验 精密称取已知重金属含量（铅、砷、镉、镍、铬元素含量分别为0.13，0.44，0.22，0.42，0.20 mg/kg）的灵芝孢子粉供试品9份，每份约1 g，共分为3组，每组3份，精密称定。分别加入重金属单标溶液（铅、砷、镉、镍、铬元素的质量浓度分别为1，0.5，1，1，10 μg/ml），具体加入量见表3，使供试品溶液中重金属浓度水平为80 %，100 %，120 %，按2.3.6项方法制备供试品溶液9份，再按2.3.4项下条件检测，计算各元素的含量、加样回收率及RSD，铅、砷、镉、镍、铬平均回收率分别为93.86 %，96.38 %，95.38 %，96.08 %，92.27 %，RSD分别为1.65 %，1.23 %，0.82 %，1.16 %，2.35 %（n=9）。表明该方法准确度较高。

表3 加样回收试验重金属单标溶液加样量（n=3）

2.3.10 重金属元素含量测定 供试品溶液注入电感耦合等离子体质谱仪，照2.3.4项下方法测定响应值，按标准曲线计算供试品溶液中重金属的含量，结果见表4。

表4 重金属元素含量测定结果（n=10）

3 多指标质量评价

分别根据多糖含量、三萜及甾醇含量、重金属含量对不同来源灵芝孢子粉进行质量评价。

3.1 根据多糖含量进行质量评价

不同树种灵芝孢子粉中，桦树树种灵芝孢子粉内多糖含量较多，多糖含量可达12.22 mg/g。不同采收期的灵芝孢子粉样品多糖含量测定结果显示，自7月底到8月上旬灵芝孢子粉内多糖含量呈上升趋势，8月上旬采集的灵芝孢子粉中多糖含量达到峰值，之后又开始下降，多糖含量最高可达10.60 mg/g。

3.2 根据三萜及甾醇含量进行质量评价

不同树种灵芝孢子粉中，桑树树种灵芝粉末和白杨树树种灵芝孢子粉中三萜类成分含量较多，最高可达30.45 mg/g。不同采收期采集到的灵芝孢子粉样品中，7月底～9月底采收的样品中，三萜及甾醇类成分呈持续上升趋势，并在9月下旬采集的灵芝孢子粉中达到峰值，三萜及甾醇含量最高可达31.79 mg/g。

3.3 根据重金属含量进行质量评价

3.3.1 重金属元素含量 食品安全国家标准食品中污染物限量标准对于食用菌制品中铅、镉、砷的要求，分别为：铅（Pb）≤1.0 mg/kg，镉（Cd）≤0.5 mg/kg、砷（As）≤0.5 mg/kg[12]。按此标准，所有样品中3种重金属含量均符合限量要求。

该标准中不包括对于食用菌制品中重金属镍及铬限量的要求。照中华人民共和国药典2020版四部中重金属镍、铬测定法进行测定，根据浙江省中药炮制规范（2015年版）：灵芝孢子粉中镍元素不得超过百万分之一；铬元素不得超过百万分之二，即镍元素不得超过1 mg/kg，铬元素不得超过2 mg/kg。根据此标准，所有样品中镍元素含量以及铬元素含量均符合灵芝孢子粉中重金属限量标准要求。

3.3.2 重金属元素总量 食品安全国家标准食品中污染物限量标准对于重金属总量的要求为：重金属总量≤20.0 mg/kg[12]。根据此标准，不同树种及不同采收期取样灵芝孢子粉样品中重金属总量均符合要求。

3.4 综合质量评价

以重金属含量为限量标准作为首要筛选条件，以多糖、三萜及甾醇等活性成分含量作为优选条件，根据两项指标权重进行加权计算，对各样本进行综合分析。加权值=灵芝多糖含量×50 %+三萜及甾醇含量×50 %。根据表1含量测定结果进行计算，结果见表5。

表5 多糖、三萜及甾醇含量加权计算结果（n=10）

初步探索不同来源样品中多糖与三萜及甾醇含量的变化规律，其中桑树树种和白杨树种灵芝孢子粉样品的多糖和三萜及甾醇加权结果最高，认为后续生产可考虑多采用桑树树种或白杨树树种进行灵芝的栽培，并在九月中下旬进行采收。

4 结论

以重金属含量为限量标准，以多糖和三萜及甾醇等活性成分含量作为优选条件，两者各占50 %比例对各样本进行加权计算，初步探索不同来源样品中多糖与三萜及甾醇含量的变化规律，其中桑树树种和白杨树种灵芝样品的多糖和三萜及甾醇加权结果最高，认为可考虑多采用桑树树种或白杨树树种进行灵芝的栽培，并在九月中下旬进行采收。