吲达帕胺片在中国健康受试者体内的人体生物等效性研究

咸瑞卿，姜树银，张迅杰，张乃斌，由鹏飞，薛维丽，贺美莲，巩丽萍

（山东省食品药品检验研究院 国家监督管理局仿制药研究与评价重点实验室 山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东 济南 250101）

吲达帕胺属噻嗪类利尿剂，20世纪80年代开始应用于临床。该药物通过利尿作用及钙拮抗剂活性发挥疗效，用于治疗轻、中度高血压，方便长效，为临床治疗高血压症的一线药物，此外还有一系列心血管保护作用[1-6]。

目前已有采用高效液相色谱（HPLC）-安培法[7]、HPLC-UV法[8]、质谱（MS）法[9]、HPLC-电化学检测法[10]、HPLC-MS法[11]、HPLC-MS/UV法[12-13]、HPLC-安培电流检测器法[14]和液相色谱（LC）-MS/MS法[15-19]测定吲哒帕胺血药浓度的报道。由于该药临床应用剂量较小，口服后人体血浆或血清中药物浓度较低，而吲达帕胺与红细胞的结合率高，全血浓度较血浆浓度、血清浓度更高、更稳定[20]。本研究建立一种测定全血中吲达帕胺浓度的UPLC-MS/MS方法，应用于生物等效性预试验，为吲达帕胺片正式生物等效性试验提供数据参考，并考察受试制剂吲达帕胺片在健康受试者中的安全性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AB SCIEX Triple Quad 5500液相色谱-质谱联用系统（美国AB SCIEX公司）；3K15台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；Allegra X-15R台式高速冷冻离心机（96孔板，美国贝克曼库尔特公司）；MDF-U5412N医用低温箱（日本松下公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水器（美国Millipore公司）；DG-2500R多管漩涡混合仪（上海巴玖实业有限公司）。数据处理软件：Analyst 1.6.3（美国AB SCIEX公司）；Watson LIMS 7.5 SPS1（美国赛默飞世尔公司）。

1.2 试药

吲达帕胺对照品（纯度97.7 %，中国食品药品检定研究院）；吲达帕胺-d3对照品（化学纯度97 %，同位素内标纯度99.3 %，加拿大TLC公司）；甲醇，乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲酸（色谱纯，美国ACS恩科化学）；N,N-二甲基甲酰胺[色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）科技有限公司]，ZnSO4·7H2O（优级纯，天津科密欧）。受试制剂：吲达帕胺片（规格：2.5 mg，批号：20171230）；参比制剂：吲达帕胺片[规格：2.5 mg，批号：968861，法国施维雅药厂（Les Laboratoires Servier Industrie）]。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制

2.1.1 吲达帕胺对照品溶液的配制 取吲达帕胺对照品适量，精密称定，加N,N-二甲基甲酰胺制成质量浓度为 1.0 mg/ml的吲达帕胺对照品储备液I，于-20 ℃ 冰箱中避光保存。精密移取吲达帕胺对照品储备液I适量，用50 %甲醇水溶液稀释并配制成质量浓度为 10.0 µg/ml的吲达帕胺对照品溶液。

2.1.2 内标（吲达帕胺-d3）溶液的配制 精密称取吲达帕胺-d3对照品适量，加N,N-二甲基甲酰胺制成质量浓度为 1.0 mg/ml的内标储备液I，精密移取内标储备液I适量，用50 %甲醇水溶液稀释至质量浓度为10.0 ng/ml，作为内标工作溶液，于-20 ℃冰箱中避光保存。

2.2 样品预处理

取96孔板，每孔加全血样品100 µl，再加内标溶液（10.0 ng/ml吲达帕胺-d3）50 µl，0.2 mol/l硫酸锌溶液50 µl，涡旋混合1 min。再加乙腈400 µl，涡旋混合5 min，置4 ℃台式高速冷冻离心机（96孔板）中，4750 r/min离心10 min ，每孔取上清110 µl，转移至另一96孔板，每孔加超纯水110 µl稀释，涡旋混合5 min，待测。

2.3 分析条件

2.3.1 UPLC条件 色谱柱：Phenomenex Kinetex C18（2.1 mm×50 mm，2.6 µm）；柱温：40 ℃ ；流动相为 0.1 %甲酸水（A相）和含0.1 %甲酸的甲醇（B相）；梯度洗脱程序见表1。流速：0.5 ml/min；进样量：10 µl。

表1 梯度洗脱程序

2.3.2 MS条件 电离方式：电喷雾离子源（ESI），正离子模式；离子源温度：550 ℃ ；检测模式：多反应监测（MRM）模式；离子化电压：5500 V ；入口电压（EP）：10 V；碰撞室出口电压（CXP）：13 V。监测离子对：吲达帕胺：366.2/132.2，碰撞能量（CE）：19 V，去簇电压（DP）：100 V；吲达帕胺-d3：369.2/135.2，CE：20 V，DP：140 V。

2.4 试验设计

筛选12例健康成年受试者，身体质量指数（BMI）在19～26 kg/m2；试验前病史、体格检查、心电图、胸片、实验室项目及试验相关各项检查、检测均正常或无临床意义的异常；女性受试者为非哺乳期，妊娠试验检查阴性；自愿参加本次临床试验，理解研究程序且已签署书面的知情同意书，能按照试验方案要求完成研究。

采用单中心、空腹、开放、随机、双周期、交叉试验设计，12名受试者随机分为两组。第I周期6例受试者口服受试制剂吲达帕胺片2.5 mg，另6例受试者空腹口服参比制剂吲达帕胺片2.5 mg，14 d后交叉给药进行第II周期研究。两周期试验分别于给药前（0 h）和给药后 0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0，36.0，48.0，72.0 h，在黄光条件下采集静脉全血4 ml，置肝素抗凝管中。混匀的全血样品被分成两份，储存于超低温冰箱（冰箱温度范围为：≤-60 ℃），用于测定全血中吲达帕胺的血药浓度。

3 结果与分析

3.1 方法学考察[21]

3.1.1 线性范围 取空白全血285 μl， 加入不同浓度的吲达帕胺对照品溶液15 μl，使样品中吲达帕胺的浓度分别为0.200，0.400，4.000，20.000，50.000，120.000，160.000，200.000 ng/ml。按 2.2 项下方法处理样品，UPLC-MS/MS测定。每个分析批采用双校正标样拟合标准曲线，采用Analyst软件对提取离子色谱图自动积分，以吲达帕胺与吲达帕胺-d3的色谱峰面积比为纵坐标（y），以全血中分析物的质量浓度为横坐标（x，ng/ml），采用加权（W=1/X2）最小二乘法，得到标准曲线回归方程为y=0.242121x+0.001773726（n=5），r2=0.9989，校正标样回算浓度均在规定范围之内，说明吲达帕胺在0.200～200.000 ng/ml范围内线性良好，据此计算得到的药物浓度准确可靠。本方法的定量下限为标准曲线的最低点0.2000 ng/ml，并满足信噪比S/N＞10。

3.1.2 残留 通过在注射定量上限浓度（200.000 ng/ml）样品后注射空白基质样品（空白全血）来评估残留。分析物和内标经色谱分离后，吲达帕胺的保留时间为 1.01 min，吲达帕胺-d3的保留时间为1.01 min，并得到较好的峰形与响应值。空白全血样品的色谱图中，分析物和内标的色谱峰保留时间附近没有干扰峰出现，说明该方法的残留小，对分析物及内标的定量均无影响。受试者服用吲达帕胺4 h后的血浆样品提取离子色谱图中，吲达帕胺和吲达帕胺-d3的保留时间分别为1.04，1.03 min，表明该方法在用于实际全血样品测定时保留时间没有发生飘移。

3.1.3 精密度与准确度 配制含吲达帕胺定量下限（0.200 ng/ml）和低、低中、中、高（0.600，10.000，80.000，150.000 ng/ml）水平的质控样品各 6份，按 2.2 项下方法进行前处理，在不同天内制备并测定3个分析批，考察批内、批间准确度和精密度。结果显示， 5个水平的质控样品批内准确度偏差范围为-6.5 %～4.5 %，批间准确度偏差为-5.5 %～1.0 %，批内精密度RSD范围为0.5 %～3.0 %，批间精密度RSD范围为0.9 %～3.5 %，见表2。表明该方法精密度、准确度均良好，符合生物样品定量分析方法验证指导原则。

表2 准确度与精密度

3.1.4 选择性、基质效应和提取回收率

3.1.4.1 选择性 采用6批不同供体的空白基质制备不添加待测物和内标的空白基质样品与定量下限样品，按 2.2 项下方法进行前处理，进样分析。本研究6批不同的空白基质干扰组分在分析物和内标保留时间的响应均为0。表明该方法具有良好的选择性，能区分目标分析物和内标与基质中的内源性组分。

3.1.4.2 基质效应 将6批来自不同供体的空白基质样品，按2.2项方法处理，向处理后的空白基质样品中分别加入低浓度（LQC）和高浓度（HQC）分析物和内标的混合溶液，配制基质效应评价样品，进样分析，所得分析物和内标峰面积与相同理论浓度的纯溶液样品的分析物和内标峰面积比较，分别考察基质效应。基质效应用内标归一化的基质因子的变异系数（CV）来评价。基质因子为基质存在下的峰面积（由空白基质提取后加入吲达帕胺和吲达帕胺-d3测得）与不含基质的相应峰面积（由吲达帕胺和吲达帕胺-d3的纯溶液测得）比值，计算每批吲达帕胺和吲达帕胺-d3的基质因子。进一步通过吲达帕胺的基质因子除以吲达帕胺-d3的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。由6批空白基质计算的内标归一化的基质因子的变异系数均不超过15 %。本研究考察了全血在LQC和HQC下的基质效应，结果见表3。结果表明该方法的基质效应符合要求。

表3 6批不同来源全血及高脂全血的基质效应

3.1.4.3 提取回收率 取空白基质，加入分析物和内标，按2.2项方法处理，进样测定；取空白基质，按2.2项方法处理，加入分析物和内标，进样测定，比较二者的峰面积均值，考察分析物（低、低中、中、高 4个质量浓度）和内标的提取回收率。4种浓度分析物的提取回收率分别为101.3 %，99.3 %， 94.5 %，97.9 %，内标的提取回收率为98.5 %，说明该方法回收率较高，提取过程不会对结果造成影响。

3.1.5 稳定性 用新鲜制备的标准曲线及质控样品，考察不同储存条件下放置的样品中吲达帕胺的稳定性，分别考察了基质样品（含吲达帕胺的全血样品）4次冻融循环稳定性、基质样品在室温放置6 h的稳定性、处理过的基质样品自动进样器温度条件下放置72 h的稳定性及基质样品在冷冻条件下（-80 ℃，-20 ℃）放置70 d的稳定性。结果见表4。由表4可见，吲达帕胺基质样品在上述条件下均能保持稳定。

表4 不同条件下的稳定性考察结果（ ±s，n=3）

表4 不同条件下的稳定性考察结果（ ±s，n=3）

浓度水平/ng·ml-1放置后吲达帕胺浓度与放置前浓度比值/%室温放置6 h自动进样器温度下放置72 h长期放置（70 d） 冻融（4次，-80 ℃）-20 ℃ -80 ℃0.600 91.5±3.8 94.7±0.5 94.7±0.9 93.2±2.8 91.2±1.3 150.000 96.7±0.9 96.5±0.3 99.1±1.2 97.9±1.7 97.2±0.3

3.2 吲达帕胺片生物等效性

采用本文建立的UPLC-MS/MS方法测定12名受试者口服受试制剂及参比制剂后的血药浓度，评价两制剂之间是否具有生物等效性。以时间为横坐标、测定的血药浓度为纵坐标，分别绘制受试制剂及参比制 剂的吲达帕胺平均血药浓度-时间曲线，见图1。

图1 平均血药浓度-时间曲线

用DAS2.0软件计算两种吲达帕胺片剂的药动学参数，结果见表5。由血药浓度-时间曲线下面积（AUC0-t、AUC0-∞）计算出受试者的相对生物利用度，结果受试制剂对参比制剂的相对生物利用度为99.5 %±6.2 %。将AUC0-t、AUC0-∞和Cmax经对数转换后，采用双向单侧t检验及（1-2α）置信区间法评价两种制剂的生物等效性。受试制剂的AUC0-t、AUC0-∞和Cmax的（1-2α）置信区间分别为参比制剂相应参数的 96.0 %～102.7 %、96.0 %～103.1 %、91.2 %～106.3 %，均在80.00 %～125.00 %范围内；AUC0-t、AUC0-∞和Cmax经对数转换后多因素方差分析结果显示给药周期、制剂间、给药序列间的差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结果表明本研究中吲达帕胺受试制剂和参比制剂在人体内的吸收速度和程度无显著性差异，具有生物等效性。

表5 受试制剂与参比制剂的主要药动学参数比较（n=12）

4 讨论

本文应用UPLC-MS/MS技术建立了测定人全血中吲达帕胺含量的方法，进行了完整的方法学验证，并应用于人体生物等效性预试验研究。该方法使用乙腈对全血样品进行蛋白沉淀，操作简便，有机试剂消耗少；定量下限为 0.2 ng/ml，定量上限为200 ng/ml，该方法可用于吲达帕胺其他剂型不同规格制剂的血药浓度检测，可减少验证次数，节约成本；在流动相选择方面，选用0.1 %甲酸水和0.1 %甲酸甲醇，可获得更好的色谱峰型；此外该方法为了减少基质效应，蛋白沉淀后取上清，用10 %乙腈水进行1:1稀释。该方法具有灵敏度高、选择性好、基质效应小等优点。在试验过程中，受试者均未有临床意义的药物不良反应出现。本试验为吲达帕胺片及吲达帕胺缓释片的生物等效性研究提供了数据参考，为正式试验奠定了基础。