胞磷胆碱钠碱降解杂质的制备与结构确证

王 鹏，许云强，孙宗彬，程战立，刘金明，李铁健，张贵民

（鲁南制药集团股份有限公司 国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 276000）

胞磷胆碱钠是合成细胞膜组分磷脂酰胆碱的中间体，为卵磷脂生物合成所需辅酶，目前广泛应用于急性颅脑损伤及手术后的意识障碍[1]。在胞磷胆碱钠注射液的质量研究中，发现相对保留时间1.8倍处有一未知杂质，其含量超过鉴定限，需对其进行研究。通过强制降解实验发现，该杂质含量在强碱性环境下能明显变大，遂使用动态轴向压缩柱制备色谱系统对其进行分离制备，并对其进行结构确证，以期为胞磷胆碱钠注射液的质量研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent）；NP7000型DAC-50动态轴向压缩柱制备色谱系统（汉邦科技）；85S2真空冷冻干燥机（美国Millrock）；R-220 pro型旋转蒸发仪（瑞士Buchi）；LAMBDA 365型紫外-可见分光光度计（美国PerkinElmer）；Nicolet IS10傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo）；AV400型核磁共振谱仪（德国Bruker）；SQD2液相色谱质谱联用仪（美国Waters）。

1.2 试药

胞磷胆碱钠（山东新时代药业，批号：183049）；甲醇，异丙醇（德国Merck，色谱纯）；磷酸氢二钾，磷酸（国药集团，分析纯）；四丁基氢氧化铵（Sigma，分析纯）；氢氧化钠，乙酸（西陇科学，分析纯）；氘代二甲亚砜（美国CIL试剂，纯度99.9 %）；乙腈（潍坊中汇，制备级）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 分析检测条件

色谱柱为Welch XB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为磷酸盐缓冲液[0.1 mol/L磷酸氢二钾溶液和四丁基氢氧化铵（取0.01 mol/L四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH 4.5）等量混合]:甲醇=95:5]，等度洗脱40 min；流速1 ml/min；柱温25 ℃；检测波长276 nm。该方法用于粗品溶液和杂质制备过程中的分析检测。

2.2 杂质样品溶液的配制

取胞磷胆碱钠适量，加水溶解并制成每1 ml中含胞磷胆碱钠10 mg的溶液，加入10 % 1 mol/L氢氧化钠溶液，置90 ℃水浴加热3 h，冷却至室温，加乙酸调至中性，得溶液A，作为杂质样品溶液。按2.1项下色谱条件检测，目标杂质色谱纯度为29.58 %，分析图谱见图1。

图1 杂质样品溶液的HPLC图谱

2.3 目标杂质的分离制备

2.3.1 制备柱装填 取干燥的Sepax HP C18填料（10 µm，120 Å）300 g，置于烧杯中，缓慢加入异丙醇并同向搅拌，保持总体积约800 ml，超声30 min进行匀浆。将匀浆液倒入DAC-50柱管中，调节气阀大小，使气压保持0.4 Mpa进行制备柱装填。保压30 min后，以萘-甲醇溶液（1 mg/ml）2 ml为测试溶液，流动相为无水乙醇，流速50 ml/min，波长254 nm，检测柱效，若N≥8000，柱效合格，若N＜8000，则柱效低，需按以上方法重新装填至合格。

2.3.2 一次分离制备 制备液相色谱条件：流动相A为0.5 %乙酸，流动相B为乙腈，流速50 ml/min，检测波长276 nm，梯度洗脱程序见表1。将2.2项下溶液A注入DAC-50动态轴向压缩柱制备色谱系统，进样体积6 ml，收集目标杂质峰所对应的洗脱液，一次制备图谱见图2。一次制备收集液置40 ℃水浴中减压旋蒸至约原体积的1/3，得溶液B，作为样品溶液进行二次分离制备。

表1 一次分离制备梯度洗脱程序

图2 一次分离制备图谱

2.3.3 二次分离制备 制备液相色谱条件：流动相A为水，流动相B为乙腈，流速50 ml/min，检测波长276 nm，洗脱程序见表2。将溶液B注入DAC-50动态轴向压缩柱制备色谱系统，进样体积20 ml，收集目标杂质峰所对应的洗脱液，二次制备图谱见图3。二次制备收集液置40 ℃水浴减压旋蒸至约原体积的1/2，得溶液C，作为待冻干样品。

表2 二次分离制备梯度洗脱程序

图3 二次分离制备图谱

2.3.4 冷冻干燥 将溶液C倒于专用不锈钢盘中，置于冻干板层，开启真空冷冻干燥机，按表3程序进行冻干，冻干结束氮气回填，氮气保护出料，最终得到360 mg白色固体粉末。按2.1项下色谱条件检测，目标杂质色谱纯度为96.34 %，分析图谱见图4。

表3 冻干程序

图4 目标杂质冻干样品的HPLC图谱

2.4 目标杂质的结构确证

2.4.1 紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）分析 目标杂质水溶液在205 nm和262 nm有较强吸收峰，两处吸收峰分别为杂芳环E2带和杂芳环B带吸收，提示分子结构中含杂芳环结构。

2.4.2 红外光谱（IR）分析 KBr压片法结果显示分子结构中含羟基、酰胺、甲基、磷酸酯和醚等结构。其中：3411.93 cm-1处的吸收峰为羟基中氧氢键的伸缩振动特征吸收峰；1701.64 cm-1处的吸收峰为酰胺中碳氧双键的伸缩振动特征吸收峰；1474.20 cm-1和1390.46 cm-1处的吸收峰为甲基中碳氢键的弯曲振动吸收峰；1264.86 cm-1和1109.29 cm-1处的吸收峰为磷酸酯中磷氧双键的伸缩振动吸收峰；1055.16 cm-1处的吸收峰为醚中碳氧碳单键的伸缩振动吸收峰；953.59 cm-1处的吸收峰为磷酸酯中磷氧单键的伸缩振动吸收峰。

2.4.3 电喷雾离子化质谱（ESI-MS）分析 目标杂质正负离子模式下的m/z分别为：490.2[M+H]+，488.2[M-H]-。

2.4.4 核磁共振波谱（NMR）分析1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：3.14（s，9H），3.62（m，2H），4.02（m，3H；m，2H），4.32（m，2H），5.64（d，1H），5.79（s，1H），7.79（d，1H），显示目标杂质含7组（共计21个）非活泼氢，从低场到高场积分比例为1:1:1:2:5:2:9，见图5。13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：53.13，59.84，65.18，65.45，69.80，73.12，82.72，87.71，102.08，140.82，150.85，163.20，显示目标杂质含14组碳信号，化学位移53.13 ppm处碳原子因化学等同发生信号重叠，见图6。HSQC谱图显示化学位移163.20 ppm和150.85 ppm处的碳原子与质子无相互耦合作用，为2组季碳。31P NMR谱图显示目标杂质含2组（共计2个）磷信号，从低场到高场积分比例为1:1，化学位移分别为-12.55，-12.68，-13.53，-13.66 ppm。

图5 目标杂质1H NMR图谱

图6 目标杂质13C NMR图谱

综合以上波谱数据及胞磷胆碱钠结构，确定该目标杂质为尿苷二磷酸胆碱（U D P C，C14H25N3O12P2），其结构见图7。

图7 UDPC结构

3 讨论

此前，有人提出，由于胞磷胆碱钠嘧啶环上的两个氮的孤对电子都没有共轭，在酸性条件下，氮与氢离子结合后有利于氨基离子（-NH3+）离去，水再作为亲核试剂取代，最后异构为杂质UDPC[2]。实验证明，碱性条件下，胞磷胆碱钠也可降解为UDPC，其降解产生机制见图8。

图8 UDPC产生机制

该杂质分离制备过程中，一次分离制备得到的目标杂质色谱纯度约92 %，二次分离制备后其色谱纯度达98 %，样品冷冻干燥后得到的固体粉末其色谱纯度为96.34 %，色谱纯度较冷冻干燥前有所降低，表明UDPC易降解，具有不稳定性。另外，发现UDPC固体具有极强的吸湿性，冻干后所得固体颗粒极易吸潮融化，较难得到高纯度的固体对照品。通过反复实验，最终确定了该杂质的分离制备方法及冷冻干燥程序，得到了色谱纯度较高的固体对照品。该分离制备及冷冻干燥过程整体可控，可为分离制备具有相似性质的该类杂质对照品提供方法与思路。

近年，杂质研究成为药品研发的重要环节。为了更充分地研究药品中的杂质，需通过技术手段对药品中的杂质进行分离纯化，以制得杂质对照品，这通常需要花费大量的人力和物力。传统的制备纯化技术已不能满足市场需求，需要成本更低、效率更高的替代技术。高压制备型液相色谱系统（Prep-HPLC）是一种新型的制备色谱技术，同传统低压制备色谱方法相比较，应用该方法分离纯化的产品在纯度、回收率和分离效率等方面具有显著优势，兼具泵流量大、进样量大及分离时间短等优点，因此在化学药物和生物制品的研究及生产领域得到广泛应用[3-10]。其中，动态轴向压缩技术（dynamic axial compression，DAC）是工业色谱中最常用、最易实现、效果更为理想的高压制备液相色谱技术。DAC系统因其柱效高，重复性好、分离效率高、制备量大等优点而受到越来越多的关注[11]。