不同产地药材牛膝的红外光谱及红外导数光谱鉴别研究

解玫莹，单圣男，李欢欢，程旺兴

(安徽中医药大学药学院 安徽省中医药研究院中药资源保护与开发研究所，安徽 合肥 230012)

中药牛膝为苋科植物牛膝

Achyranthes

bidentata

Bl.的干燥根，味苦、酸，性平，归肝、肾经，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行等功效。牛膝的根含有多种生物活性成分，包括皂苷类、甾酮类、糖类、氨基酸、生物碱及香豆素类等，具有抗肿瘤、镇痛消炎、促进蛋白质合成和促进胃肠兴奋性等多重临床药理作用。牛膝种植范围较广，主产于河南，河北、山东、内蒙古、安徽等地也有栽培，而产于河南焦作市武陟县、温县等地的牛膝，由于生长环境得天独厚而成为久负盛名的道地药材，习称“怀牛膝”。目前，市场上售卖牛膝的渠道较多，许多商家将非道地产区的牛膝冒充道地药材出售，导致药材质量的稳定性下降。与此同时，牛膝为常用中药，其市场销售的不稳定性也使得临床药效难以得到保障，故对不同产地的牛膝进行有效的区分具有重要意义。牛膝的主要鉴定技术包括显微鉴定和理化鉴定等，但常规的高效液相色谱指纹图谱技术也存在一定的缺陷，其样品需要经过提取和纯化等预处理过程，不仅不能完整反映中药所含的信息，而且实验繁琐。

红外光谱法是目前鉴别化学物质结构的一种常用方法，能直观地表现出中药材所含复杂成分的化学结构信息。红外光谱技术应用于中药类鉴别可以实现全组分分析且无损耗，具有分析速度快、分析成本低、分析效率高等特点，可以对中药的来源、所含化学物质等进行有效地分类识别。庞丹清等构建不同产地和不同极性部位的当归藤红外光谱图，对其进行特征分析。皇甫义静等利用傅里叶变换红外光谱，对金银花产地进行鉴别。黄冬兰等采用红外光谱、二阶导数红外光谱和二维相关红外光谱，对4种不同产地的黄芪原材料进行鉴别研究。因此，本研究采用傅里叶变换红外光谱法结合红外二阶导数图谱深层次地辨别不同产地牛膝所含化学成分的差异，初步建立牛膝的鉴别和质量控制新方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 傅里叶红外光谱仪(Nicolet iN10 MX)：美国Thermo公司；红外光谱分析软件(OMNIC V8.3)：美国Thermo公司；高速多功能打粉机(BJ-150型)：德清拜杰电器有限公司；真空干燥箱(BZF-30型)：上海博讯实业有限公司。

1.2 样品来源与制备 牛膝药材信息如表1所示，经安徽中医药大学杨青山老师鉴定为苋科植物牛膝

Achyranthes

bidentata

Bl.的干燥根，按文献[17]的方法将干燥后的牛膝药材放入打粉机中打碎，粉末过80目筛，备用。

表1 牛膝药材来源信息表

2 方法

2.1 实验方法 红外光谱测定前用无水乙醇擦拭检测台，再取样品粉末适量，置于实验测定的金刚石表面，旋转SMART ITR附件的固定旋钮将样品固定并压成透明薄片，选择实验条件(每张光谱累加扫描16次，光谱分辨率4 cm，扫描过程中实时扣除水和二氧化碳干扰，纵坐标为吸光度)，扫描，可得样品粉末相对应的红外光谱图。二阶导数谱是取原始谱图各点的二阶导数，平滑点数为13。

2.2 数据处理 聚类分析法是一种用于研究分类的多元统计方法，其目的就是在相似的基础上对收集来的数据进行归类，本实验应用聚类分析法分析红外图谱的各项数据，用SPSS 23.0软件进行数据整理、作图，得到样品的聚类分析树状图，直观地反映各样本间的相似关系。

主成分分析也称主分量分析，是一种通过降维，以少量综合指标代替原来多个指标的统计方法，本实验采用SPSS 23.0软件进行主成分分析，为不同产地牛膝鉴别提供依据。

3 结果

注：a.山东省菏泽市；b.内蒙古自治区赤峰市；c.河南省焦作市武陟县；d.河南省焦作市温县；e.河北省保定市；f.河北省安国市；g.贵州省毕节市；h.安徽省亳州市；i.云南省昆明市；j.陕西省商洛市

通过对不同产地牛膝药材红外光谱图的分析可知，在4 000～1 800 cm范围内，10个产地的牛膝药材相似度较高，但在1 800～800 cm区间，红外光谱图中吸收峰位置和相对峰强具有一定的差异。例如，陕西省商洛市的牛膝药材在1 723 cm附近的吸收峰强度明显高于其他9个产地；在1 630 cm附近，贵州省毕节市的出峰位置相较于平均峰位向右偏移了13个波数；在1 321 cm附近，内蒙古自治区赤峰市和河南省焦作市武陟县的牛膝药材吸收峰强度相近，且高于其他8个产地；山东省菏泽市的牛膝样品在1 113 cm附近存在有相对明显的吸收峰；山东省菏泽市、内蒙古自治区赤峰市、河南焦作市温县、河北省安国市、安徽省亳州市和云南省昆明市的牛膝样品在1 018 cm附近出现双峰。综上所述，红外光谱可为不同产地牛膝药材的鉴别提供依据。

3.2 不同产地牛膝的二阶导数红外光谱分析 红外二阶导数图谱是对红外光谱图的重叠峰进行一定程度的剥离，从而提高图谱的分辨率，本研究采用二阶导数光谱(见图2)对不同产地牛膝的红外峰在1 800～800 cm范围内进行比较分析，山东省菏泽市和贵州省毕节市牛膝的二阶导数红外吸收峰强度相对较弱；陕西省商洛市牛膝的吸收峰形状相较于其他9个产地有明显的差异。在1 800～1 600 cm范围内，河北省安国市在1 735 cm处的吸收峰峰强是10个产地中最高的；在1 630 cm附近，内蒙古自治区赤峰市、河南省焦作市武陟县两个产地的吸收峰强度明显高于其他产地；河南省焦作市温县、河北省保定市、河北省安国市、安徽省亳州市和云南省昆明市5个产地牛膝在1 652 cm附近的吸收峰强度明显大于1 683 cm附近的，而山东省菏泽市、内蒙古自治区赤峰市、河南省焦作市温县、贵州省毕节市和陕西省商洛市5个产地牛膝在1 652 cm附近的吸收峰强度明显小于1 683 cm附近的吸收峰强度；在1 300～1 000 cm区段，各产地牛膝药材的吸收峰形状差异较大，山东省菏泽市、河南省焦作市温县、贵州省毕节市和陕西省商洛市的吸收峰形状各不相同，易于区分；内蒙古自治区赤峰市、河南省焦作市武陟县、河北省保定市和河北省安国市在1 241 cm附近有较为明显的吸收峰；安徽省亳州市和云南省昆明市在1 058 cm附近吸收峰形状相似。综上可知，二阶导数红外光谱可为不同产地牛膝药材的鉴别提供更准确的依据。

注：a.山东省菏泽市；b.内蒙古自治区赤峰市；c.河南省焦作市武陟县；d.河南省焦作市温县；e.河北省保定市；f.河北省安国市；g.贵州省毕节市；h.安徽省亳州市；i.云南省昆明市；j.陕西省商洛市

3.3 不同产地牛膝的聚类分析 本实验不同产地牛膝样品中河南省11批，内蒙古自治区5批，河北省3批，云南省4批，贵州省3批，其余产地由于产量较小，各1批，每个批次样本测定3次，取平均图谱，再利用聚类分析法对29批不同产地牛膝的红外图谱进行分析，所得树状图如图3所示。由图3可知，当欧氏距离大于5时，同一产地不同批次的牛膝药材大致聚为一类，表明不同批次的药材相似度较高；当欧式距离为11时，29份牛膝样品聚成两大类，一类主要为河南省焦作市武陟县、内蒙古自治区赤峰市、河北省保定市、云南省昆明市和贵州省毕节市所产牛膝，另一类主要为山东省菏泽市、安徽省亳州市、陕西省商洛市、河南省焦作市温县所产牛膝。

注：a.山东省菏泽市；b.内蒙古自治区赤峰市；c.河南省焦作市武陟县；d.河南省焦作市温县；e.河北省保定市；f.河北省安国市；g.贵州省毕节市；h.安徽省亳州市；i.云南省昆明市；j.陕西省商洛市

3.4 不同产地牛膝的主成分分析 主成分分析是通过收集数据中主要信息，采用降维的方式，用尽量少的数据概括尽量多的信息的数据处理方法。本研究选择不同产地牛膝药材红外图谱中10个共有峰，将其吸光度值导入SPSS 23.0软件，建立主成分分析模型。由表2和图4可知，牛膝药材的主成分分析中前2个主成分的特征值>1，累积方差贡献率高达90.593%，且碎石图的连线较陡峭，因此选取前两个主成分进一步分析。

表2 主成分分析解释的总变量

图4 主成分分析碎石图

成分载荷矩阵反映各成分与原始指标之间相互关系的密切程度与作用的方向，载荷的绝对值越大，其对主成分的影响就越大。表3为本实验的主成分载荷矩阵。

表3 主成分载荷矩阵

由主成分矩阵可知，对主成分1贡献较大的有1 630 cm处的吸收峰以及糖类特征吸收峰等，对主成分2贡献较大的是1 723 cm附近的吸收峰。

图5为29批牛膝的主成分得分图，由图可看出不同产地牛膝药材的分布具有一定的规律性，陕西省商洛市、安徽省亳州市和山东省菏泽市均处于主成分1得分小于-5处，但陕西省商洛市的主成分2得分较高；云南省昆明市集中处在主成分1和2得分均为0处；河南省焦作市温县处于云南的左侧，主成分2得分小于0；河北省安国市处于河南省焦作市温县和安徽省亳州市之间；贵州省毕节市主要集中于主成分2得分小于0处，与河南省焦作市武陟县相邻；河南省焦作市武陟县和内蒙古自治区赤峰市均集中于主成分1得分为2.5处，但河南省焦作市武陟县的主成分2得分小于0，内蒙古自治区赤峰市的主成分2得分大于0。由此可见，红外光谱技术结合主成分分析不仅能鉴别不同产地的牛膝药材，并且能够反映牛膝药材中部分有效成分含量的差异。

注：a.山东省菏泽市；b.内蒙古自治区赤峰市；c.河南省焦作市武陟县；d.河南省焦作市温县；e.河北省保定市；f.河北省安国市；g.贵州省毕节市；h.安徽省亳州市；i.云南省昆明市；j.陕西省商洛市

4 讨论

由于不同产地的牛膝药材生长环境不同，其所含化学成分的量也有所差别，故本实验利用红外光谱结合红外二阶导数光谱，依据各类红外特征吸收峰形状、位置和强度的差异对不同产地牛膝药材进行鉴别。在红外光谱中，各产地牛膝药材的吸收峰形状相似度较高，主要通过吸收峰位置和相对峰强对不同产地牛膝进行区分；二阶导数图谱由于一定程度剥离了红外光谱中复杂成分所产生的重叠峰，可以更加明显地体现出不同产地牛膝药材的差异性。同时聚类分析结果表明，同一产地不同批次之间相似度很高，但不同产地牛膝药材在一定的欧氏距离下分为两大类；其中河南省焦作市温县和武陟县也被分为不同的两类，可见即便地理位置相近，牛膝药材的化学成分可能也有一定的差异性。主成分分析结果表明，内蒙古自治区赤峰市和河南省焦作市武陟县的牛膝药材综合评分较高。综上所述，红外光谱法结合二阶导数图谱能够为鉴别不同产地的牛膝药材提供很好的依据，是牛膝药材质量控制研究的一种新方法。