肥儿散质量标准研究
2021-12-20孔国勇李慧雯郑惠韵翁立冬
孔国勇，李慧雯，郑惠韵，翁立冬
(1 广州市番禺医药质量管理协会，广东 广州 511400；2 南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515)
肥儿散由白术、甘草、山药、茯苓、南山楂和鸡内金等6味药材制成，具有健脾、消食、化积等作用，用于治疗脾胃不和引起的脾虚泄泻、消化不良、面黄肌瘦、疳积腹胀[1-2]。《中国药典》2020版尚未收载该成药，目前该成药被收载于国家卫生部中药部颁标准21册，标准编号为WS3-B-3885-98。原标准中只有显微鉴别项，缺乏控制该制剂质量的有关研究，准确性、专属性较低。本研究选用薄层色谱法鉴别方中白术、甘草、山药、茯苓、南山楂和鸡内金，用高效液相色谱法对甘草酸进行含量测定，研究如下。
1 仪器与试药
PTY-124/105型十万分之一电子天平，上海诺萱科学仪器有限公司；GoodLook-2000型全自动薄层色谱成像仪，上海科哲生化科技有限公司；CR-020S型超声波清洗机，深圳市春霖清洗设备有限公司； 1260型高效液相色谱仪，美国Agilent；硅胶G薄层板，自制。
甘草酸铵对照品(批号110731-200513)及各对照药材，均购自中国食品药品检定研究院；肥儿散(批号：20130701、20130920、20131025)，汕头市时代制药有限公司；乙腈为(色谱纯)，德国默克；水为双蒸水；其它试剂购自广州化学试剂厂，为分析纯。
2 实验方法
2.1 薄层色谱鉴别
2.1.1 白术[3-4]
图1 白术薄层色谱图
取本品6 g，加醋酸乙酯30 mL超声提取20 min，过滤，滤液挥干醋酸乙酯，剩余残渣加环己烷1 mL溶解作为供试品溶液。取白术对照药材1 g，加醋酸乙酯10 mL同上述处理制成对照药材溶液。照薄层色谱法，吸取两种溶液各10 μL，点于硅胶G薄层板上，用石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯(7.5:0.5)比例作为展开剂，展开，取出，晾干，喷5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱与白术对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
2.1.2 山药[5-6]
取本品6 g，加甲醇30 mL超声提取30 min，过滤，滤液浓缩至约1 mL作为供试品溶液。取山药对照药材1 g，加甲醇 20 mL同上述处理制成对照药材溶液。照薄层色谱法，吸取两种溶液各10 μL，点于硅胶G薄层板上，用环己烷-丙酮(5:1.5)比例作为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，然后置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱与山药对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图2。
图2 山药薄层色谱图
2.1.3 甘草[7-8]
取本品6 g，加乙醚40 mL水浴加热回流1 h，过滤，药渣加甲醇30 mL加热回流1 h，过滤，滤液蒸干，剩余残渣加水20 mL溶解，用正丁醇萃取三次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，取正丁醇液蒸干，剩余残渣加甲醇5 mL溶解作为供试品溶液。取甘草对照药材1 g，同上述处理制成对照药材溶液。照薄层色谱法，吸取两种溶液各5 μL，点于硅胶G薄层板上，用石油醚(60～90 ℃)-甲苯-醋酸乙酯-冰乙酸(5:10:3.5:0.25)比例作为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱与甘草对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图3。
图3 甘草薄层色谱图
2.1.4 南山楂[9-10]
取本品6 g，加醋酸乙酯30 mL超声提取30 min，过滤，滤液蒸干，剩余残渣加正己烷1 mL溶解作为供试品溶液。另取南山楂对照药材1 g，加醋酸乙酯10 mL，同上述处理制成对照药材溶液。照薄层色谱法，吸取供试品溶液10 μL、对照药材溶液5 μL，点于硅胶G薄层板上，用甲苯-醋酸乙酯-甲酸(10: 2:0.25)比例作为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，在80 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱与南山楂对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光灯(365 nm)下检视，显相同的橙黄色荧光斑点，见图4。
图4 南山楂薄层色谱图
2.1.5 茯苓和鸡内金[11-12]
取本品6 g，加乙醚40 mL超声提取30 min，过滤，滤液挥干，剩余残渣加正己烷1 mL溶解作为供试品溶液。另分别取茯苓对照药材和鸡内金对照药材各1 g，各加乙醚20 mL同上述处理制成茯苓对照药材溶液和鸡内金对照药材溶液。照薄层色谱法，吸取供试品溶液10 μL、茯苓对照药材溶液和鸡内金对照药材溶液各5 μL，点于硅胶G薄层板上，用氯仿-醋酸乙酯-甲酸(5:0.5:0.1)比例作为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱与茯苓、鸡内金对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图5。
图5 茯苓、鸡内金薄层色谱图
2.2 含量测定
2.2.1 溶液制备
2.2.1.1 对照品溶液
精密称定甘草酸铵对照品16 mg，精密加入流动相溶液 500 mL，超声使溶解，即得每1 mL含甘草酸铵32 μg的对照品标准液，相当于每1 mL含甘草酸31.344 μg·mL-1。
2.2.1.2 供试品溶液
精密称取本品约0.3 g，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相溶液25 mL，密塞，称重，浸泡1 h，再超声处理30 min，放冷，称重，用流动相溶液补足重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得。
2.2.1.3 阴性溶液
按处方各味药材比例，称取除甘草外的其余药材，先按制备工艺制得阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性溶液。
2.2.2 色谱条件[13]
色谱柱：Agilent C18柱，250 mm × 4.6 mm，5 μm；流动相：乙腈-0.015 mol·L-1磷酸溶液(39:61)；柱温：25 ℃；流速：1 mL·min-1；检测波长：250 nm。
2.2.3 系统适应性分析实验
2.2.3.1 专属性
取上述三种溶液注入色谱仪，进样量10 μL。甘草酸(铵)在10～11 min之间有特征吸收峰，说明该色谱条件的方法专属性较好，见图6。
图6 甘草酸高效液相色谱图
2.2.3.2 线性关系
分别精密吸取对照品标准液4、8、12、16、20 μL，注入色谱仪，以测得的甘草酸峰面积S为横坐标，含量m为纵坐标，经线性分析得回归方程为：m=0.0014S+0.0018(R2=1)，结果表明甘草酸在0.125376～0.62688 μg范围内呈良好的线性关系，见表1。
表1 甘草酸线性关系
2.2.3.3 精密度
对照品标准液连续进样5次，每次10 μL，测定，计算峰面积的RSD为0.33%，表明仪器的精密度良好，结果见表2。
2.2.3.4 重复性
精密称取样品6份，按“2.2.1.2”项下制成6份溶液，以10 μL进样分析，测得峰面积，计算甘草酸的平均含量为3.7453 mg·g-1，RSD为0.72%，表明实验重复性良好，结果见表2。
2.2.3.5 稳定性
精密称取样品，按“2.2.1.2”项下制成溶液，分别设定时间为0，5，10，15，20，24 h时进样10 μL分析，计算峰面积的RSD为0.31%，表明供试品溶液在至少24 h内测定时稳定，结果见表2。
表2 精密度、重复性和稳定性等实验结果
2.2.3.6 加样回收率试验
分别取6份同一批已知甘草酸含量(3.7453 mg·g-1)的样品0.15 g，精密称重，置于6只具塞锥形瓶中，各精密加入含甘草酸的标准品溶液(31.344 μg/mL)18mL，再精密加入流动相溶液7 mL，密塞，称重，浸泡1 h，再超声处理30 min，放冷，称重，用流动相溶液补足重量，摇匀，用微孔滤膜滤过，各以10 μL进样，计算含量、回收率和RSD，结果见表3。
表3 甘草酸加样回收率试验
2.2.4 含量测定结果
取样品三批，按供试品溶液制备方法制备3份样品，按色谱条件进样分析，测定甘草酸含量，三批肥儿散样品中甘草酸的平均含量约为3.7087 mg·g-1，结果见表4。
表4 样品含量测定结果
3 讨 论
3.1 薄层色谱方法选择
本次实验中除鸡内金外其余白术、甘草、山药、茯苓和山楂等药材均在《中国药典》2020年版一部中有收载薄层色谱鉴别方法[3，5，7，9，11]，亦参考了一些文献报道的鉴别方法[4,6,8,10,12]，综合分析之后选定了以上正文条件。其中白术鉴别时展开剂比例为石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯(15:1)时较比例为石油醚(60～90 ℃)- 醋酸乙酯(50:1)能更好地达到分离鉴别；山药鉴别采用文献的提取及显色方法比药典的方法能更清晰地鉴别；茯苓及鸡内金二者因皆含有蛋白质和氨基酸成分[14～15]，鉴别时阴性产生干扰，经过多次试验，最终决定采用双阴性可达到进行鉴别。
3.2 薄层色谱方法考察
对建立的薄层色谱方法进行了色谱条件考察，通过不同薄层板(实验室自制薄层板与青岛海洋化工厂生产的预制板)进行了对比，均可鉴别。亦选择了不同的温湿度进行考察，亦均可鉴别。
3.3 流动相选择
甘草药材中的甘草酸是其特征成分，性质较稳定[16]，测定其含量可有效控制产品质量。已有文献报道过肥儿散中甘草酸铵的含量测定[13]，流动相为乙腈-0.015 mol·L-1磷酸(40:60)，但实验发现，主峰拖尾严重。尝试调节流动相的比例为乙腈-0.015 mol·L-1磷酸(39:61)时，效果较好，分离度、拖尾因子、塔板理论数都达到要求。
