分光光度法检测奥贝胆酸与白藜芦醇联合在脂肪肝细胞的作用

高 川 付海洋 刘 敏 周奎臣

(1.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院检验科，黑龙江 佳木斯 154007)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)包括了非酒精性脂肪肝(NAIL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，NASH疾病发展严重时可导致肝硬化、肝细胞癌(HCC)，必要时须进行肝脏移植。近些年来，NAFLD的发病率越来越高，NASH患病率也进一步增加,并且NAFLD尚无公认的特效治疗方法[1，2]。奥贝胆酸(Obeticholic acid，OCA)，是法尼酯 X受体(Farnesoid X receptor, FXR)的天然配体，能够调节肝脏脂质，促进细胞再生，保护肝脏，但其存在瘙痒等不良炎症反应[3]。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)具有很好的抗炎症、抗氧化效果[4]。SOD和MDA是评价氧化应激的两个指标，检测方法有ELISA、蛋白凝胶电泳、分光光度法等。本文用分光光度法检测OCA联合RSV在NAFLD细胞模型上的应用，以评价抗氧化应激和降脂效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料

药品：奥贝胆酸(厦门海乐景生化有限公司);白藜芦醇(上海迈瑞尔化学技术有限公司)；试剂：游离脂肪酸(棕榈酸∶油酸=1∶2，棕榈酸：天津市科密欧化学试剂有限公司，油酸：西陇科学股份有限公司);MDA、SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

仪器：紫外可见分光光度计(岛津仪器(苏州)有限公司)。

1.2 实验对象

以HepG2细胞为实验对象，调节细胞密度为1×105/mL，加入24孔培养皿中培养24 h。

1.3 药物干预

细胞贴壁后，加入正常培养基的为对照组(CON),其余组在均加入含有500 μmol/L游离脂肪酸的培养基后，分为模型组(MOD)、联合用药组(OCA+RSV)、奥贝胆酸组(OCA)，每组3个复孔，继续培养24 h；各给药组加入各药物的浓度为5 μmol/mL，继续培养24 h。

1.4 结果检测

培养完成后，取各组的培养液300 μL分别装在1.5 mL的EP管中，4 ℃保存备用。

1.4.1 油红染色

药物作用后各孔除去培养液并用PBS洗涤细胞2次，4%多聚甲醛固定10 min；吸去多聚甲醛再用PBS洗涤2次，用60%的异丙醇溶液洗涤细胞1 min；去除异丙醇溶液加入油红染色液染色10 min；加入蒸馏水终止染色，吸去液体在倒置显微40×10倍镜下观察细胞脂质结果，如图1。

1.4.2 氧化应激检测

取备好的细胞培养液100 μL，按照试剂盒说明配液，利用分光光度仪检测吸光度，MDA在532 nm、SOD在550 nm处有最大吸收，计算出细胞培养液中SOD和MDA的含量。

1.5 数据统计处理

2 结果

各组细胞的油红染色结果显示(图1)，在游离脂肪酸刺激下细胞脂质增多，加入药物的两组差别不大，都对细胞的脂肪变起到一定的抑制效果，与模型组对比，细胞脂质均明显减少。

图1 油红染色结果

分光光度法检测MDA含量精确度可达0.01 nmol/mL,SOD活性值精确度达0.01 U/mL。经检测，OCA能够降低MDA含量和SOD活性，均值分别为17.75 nmol/mL和32.66 U/mL。但联合用药的效果更好，MDA含量均值为9.38nmol/mL，SOD活性降低也较明显。P<0.05，差异均有统计学意义。

表1 各组SOD和MDA检测结果

3 讨论

NAFLD是全球发病最高的慢性肝病，发病机制主要以“二次打击学说”为主。“第一次打击”是由于肥胖、糖尿病等因素导致肝脏中脂肪堆积，形成单纯性脂肪肝，“第二次打击”是由于炎症、氧化应激、脂肪因子调节紊乱等因素对肝脏的损伤，严重时可导致NASH 甚至纤维化等[5]。迄今为止，依然没有治疗本病的特效西药，临床大多从抗氧化、保护肝细胞、抗炎、调脂等方面进行治疗，但单一的治疗方法并不能取得很好的治疗效果。

奥贝胆酸为一种特异很强的FXR受体激动剂，该药临床上主要应用于胆汁性胆管炎[6]，在NAFLD的治疗中取得一定疗效。目前该药还处于临床试验阶段，目前发现其有皮肤瘙痒、血脂异常等副作用，预计通过对其结构的改良升级或采取联合用药等方式可改善其副作用并拓宽用药范围，有望应用于NAFLD患者的临床治疗[7]。

白藜芦醇作为天然抗氧化剂，降低MDA水平，可增加细胞内SOD分子的表达，与细胞代谢及寿命具有紧密联系，同时研究显示其还具有显著的抗感染、抗肿瘤、抗高脂血症等活性[8]。

综上所述，本文选用分光光度法检测OCA和RSV联合用药作用于HepG2细胞非酒精性脂肪肝模型的作用。联合用药能够降低细胞的脂肪变，同时降低细胞发生脂肪变时的氧化应激反应，减少细胞损伤和死亡，比单独使用OCA取得更好的疗效，有进一步进行深入研究的价值。