铁皮石斛AP1 MADS-box基因克隆与表达分析

袁 慧，邹玉顺，赵银河

(云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201)

1991年，Coen等[1]提出了植物开花的ABC模型，之后科学家对其深入研究发现与花器官发育相关的MADS-box基因。MADS-box基因是一段保守性较强的DNA序列。随着科学技术的发展，ABC模型得到了更深入的研究和完善，使其成为科学家研究花发育的经典模型；其中，A类基因单独控制花器官中萼片的发育，和B类基因一起调控花瓣的发育，是控制花发育的重要因子；A类基因包括AP1和AP2，但是AP2基因不含MADS-box结构域[2]。

将AP1或者其同源基因转入某些植物中，该基因的表达均使转基因植物提前开花[3]。说明AP1MADS-box基因可以促进植物开花。AP1基因的功能丧失则导致开花延迟和花形态的改变[4]。在烟草[5]和拟南芥中转入了AP1基因后，发现这两种植物都出现了提前开花的现象[6-7]。大豆GmAP1基因是AP1同源基因，将其转入拟南芥中，导致植株出现早花现象[8]。由于AP1基因是一个具有保守性的基因，利用其保守的特点，目前，文心兰[9]、荷花[10]、杨树[11]和莲瓣兰大雪素[12]等多个植物中的AP1基因已经被成功克隆，并且获得相关的生物学信息，这将有利于以后对AP1基因进行更深入的研究。

AP1MADS-box基因在成花过程中的表达对花的发育有十分重要的意义。且AP1MADS-box基因多在花芽中表达，在营养器官中表达量较低或无表达[13]。武丹[14]对水仙11个成花基因进行研究发现，AP1基因在花蕾中有相对较高的表达量，而在根、鳞茎、叶片、花中表达量较低。在牡丹开花基因中，PsFUL1属于AP1/FUL亚家族，主要在花芽中表达，在根中表达量低[15]。麻疯树中的JcAP1基因在花序芽、花芽、萼片和花瓣中表达，在花芽的早期发育阶段观察到最高的表达水平[16]。蒋琦妮等[17]研究表明，桂花的OfAP1基因在桂花成花转变、花芽分化和发育中有重要作用。

铁皮石斛(DendrobiumcandidumKimura et Migo)是兰科草本植物，花期3月—6月，主要分布于我国云南、贵州等省，是我国重要的药用植物。铁皮石斛中含有多种有效成分，其中石斛多糖具有免疫作用和抗菌作用[18]。本研究以铁皮石斛为试验材料，克隆获得了AP1-A和AP1-BMADS-box这两个同源基因。采用RT-PCR和荧光定量PCR方法研究这两个基因在铁皮石斛花器官和叶片中的表达模式。通过对铁皮石斛AP1-A和AP1-BMADS-box基因的初步研究，明确该基因的基本生物学特征和表达模式，为深入研究该基因在铁皮石斛花发育中的分子机制提供资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

铁皮石斛购于昆明市斗南花卉市场。采集铁皮石斛花的萼片，花瓣，唇瓣，合蕊柱，以及叶片，分别保存，用液氮速冻，并保存于-80 ℃。

1.2 RNA的提取

将所采集的材料放于液氮中快速研磨充分，粉末放入5 mL EP管中，使用Trizol试剂，根据说明书提取RNA。提取之后进行琼脂糖凝胶电泳，对RNA的纯度和浓度进行检测。需要注意的是，铁皮石斛RNA在提取时容易降解，应该准备足够的液氮，以确保提取顺利。然后用该RNA为模板进行反转录合成cDNA。

1.3 引物的设计及PCR

以cDNA为模板进行PCR扩增， PCR反应体系为模板DNA 1.00 μL，dNTP 2.00 μL，10×Buffer 2.50 μL，3′primer 1.00 μL，5′primer 1.00 μL，rTaq0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。总体积为25.00 μL。PCR仪反应程序为94 ℃ 3 min 30 s，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，4 ℃ ∞。设定35个循环。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 AP1基因的克隆

PCR扩增后进行产物纯化，与PGEM-T载体连接，然后转化大肠杆菌感受态DH 5 α细胞，将培养基放在37 ℃下培养，长出菌斑后，随机选择白色菌落培养繁殖，之后进行菌液的PCR扩增，质粒抽提按照TIANGEN的TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒进行，最后质粒测序，进行测序分析。

1.5 AP1基因的表达

取铁皮石斛的幼叶，花萼，花瓣，唇瓣，合蕊柱提取RNA，将其逆转录为cDNA后，进行RT-PCR反应，然后利用琼脂糖凝胶电泳检测，查看表达情况。为了进一步获得AP1MADS-box基因在铁皮石斛各个花器官及叶片中的相对表达量，使用荧光定量PCR技术进行该基因的表达分析。

2 结果与分析

2.1 RACE的结果

PCR扩增后，对AP1-AMADS-box基因的PCR产物进行凝胶电泳检测，发现在1 000 bp处有一条明显发亮的条带，对AP1-BMADS-box基因的PCR产物进行凝胶电泳检测，发亮条带在750 bp处。利用RACE技术对AP1-AMADS-box基因和AP1-BMADS-box基因的全长cDNA进行克隆，在NCBI网站上进行序列相似性分析，发现AP1-AMADS-box基因属于AP 1/FUL 2类基因家族。

注：M为DNA Marker；1,2,3…10为PCR产物。图1 AP1-A MADS-box和AP1-B MADS-box基因电泳图Fig.1 Electrophoresis of AP1-A MADS-box and AP1-B MADs-box genes

图2 AP 1-A MADS-box氨基酸序列Fig.2 Amino acid sequence of AP 1-A MADS-box

2.2 序列分析

在NCBI的ORF Finder网站上进行AP1-AMADS-box基因和AP1-BMADS-box基因的序列分析。结果显示，AP1-AMADS-box基因的开放阅读框为762 bp，共编码253个氨基酸，AP1-BMADS-box基因的开放阅读框为642 bp，编码213个氨基酸。将AP1-AMADS-box的基因序列进行blast分析，发现该基因与春兰、建兰的AP1基因同源性分别达到了94%、99%，并且与文心兰MADS-box转录因子基因序列有85.50% 的一致性。将AP1-BMADS-box继续进行blast，结果该序列与春兰中MADS-box基因序列相似度为66%，与小兰屿蝴蝶兰MADS-box转录因子的基因序列相似度是68%。

2.3 AP1 MADS-box基因在不同组织和器官中的表达

为了更好地了解AP1MADS-box基因的功能, 利用RT-PCR方法检测了其在铁皮石斛花器官和组织中的表达情况，发现AP1-A和AP1-BMADS-box基因在幼叶和花器官中的表达存在差异。AP1-AMADS-box基因在唇瓣和合蕊柱中的表达量最高，图5中可以看到清晰的第4、第5条带，在萼片中的表达量较低，条带较暗，而在叶片、花瓣中几乎没有表达，AP1-BMADS-box基因在萼片、唇瓣和合蕊柱中的表达量比在幼叶、花瓣中的表达量高，条带较明亮，与AP1-AMADS-box基因的表达相似。

图3 AP 1-B MADS-box氨基酸序列Fig.3 Amino acid sequence of AP 1-B MADS-box

注：1为幼叶；2为萼片；3为花瓣；4为唇瓣；5为合蕊柱。图4 AP1-A MADS-box和AP1-B MADS-box基因在幼叶和花器官中的表达Fig.4 Expression of AP1-A MADS-box and AP1-B MADS-box genes in young leaves and flower organs

图5 铁皮石斛AP1-A和AP1-B MADS-box基因的Real-Time PCRFig.5 Real-time PCR of AP1-A and AP1-B MADS-box genes in D. candidum

荧光定量PCR结果显示，AP1-AMADS-box基因和AP1-BMADS-box基因在铁皮石斛不同器官中的表达量差异较大。其中AP1-AMADS-box基因在花瓣和合蕊柱中表达量最高，AP1-BMADS-box基因在唇瓣中出现高表达，而这两个基因在叶片中的表达量都很低，AP1-BMADS-box基因在花瓣中微量表达。

3 讨 论

在本研究中，AP1-AMADS-box基因和AP1-BMADS-box基因在琼脂糖凝胶电泳检测中出现明显条带，被成功克隆。进行测序后，了解它们编码的氨基酸个数分别是253个和213个。然后将获得的序列在NCBI网站上进行Blastx分析，发现这两个基因的序列与某些兰科植物的AP1基因序列同源性较高，如春兰、建兰等。有研究发现，AP1基因突变会使花瓣和萼片发育不正常[19-20]，甚至出现无花现象[21]。本研究中，铁皮石斛AP1-AMADS-box基因主要在唇瓣和合蕊柱中表达，AP1-BMADS-box基因主要在萼片、唇瓣、合蕊柱中表达，对这两个基因进行荧光定量Real-Time PCR分析发现，其表达量与RT-PCR结果有部分出入，但其大体趋势吻合。推测AP1MADS-box基因在铁皮石斛成花过程中发挥着重要的作用。

不同植物的AP1基因在不同组织和器官中的表达有所差异。在本研究中，AP1基因主要在唇瓣、合蕊柱和萼片中表达。陈丽园[22]对红花玉兰的AP1基因研究发现，AP1基因在叶片、苞片、花被片、雄蕊和心皮中都有表达。桂花成花基因AP1在花芽中的表达量最高，而在营养组织叶、茎、根中的表达量较低[23]。

铁皮石斛是一种宝贵的药用植物，目前已从铁皮石斛中克隆出多个功能性基因，如抗逆相关基因[24]，但是对铁皮石斛花发育相关基因的研究较少，而且对许多基因的研究仅仅停留在基因的克隆、序列分析和表达上，缺少相关基因的功能研究。