消毒药实验室筛选及其非洲猪瘟复产前空猪舍临床消毒使用效果评价

王亚超，胡 茂，何 健，2，李元凤，2，陈宇晨，蒋 立

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010；2.铁骑力士集团冯光德实验室，四川 绵阳 621006）

自2018年8月中国报道第一例非洲猪瘟以来，非洲猪瘟给国内养猪业造成了巨大的经济损失[1-3]。由于目前还未研发出安全有效的疫苗和治疗药物，生物安全已成为防控非洲猪瘟的行业共识[4-5]。作为生物安全的一项重要工作，消毒是切断传播途径、杀灭非洲猪瘟病毒的关键举措，但是针对市场上琳琅满目的消毒剂，部分从业者缺乏相关的专业知识，恐慌性盲目消毒，不仅未达到预期消毒效果，过量或滥用消毒药还会对环境造成污染、用药成本浪费增加，以及对人员和猪群造成不利影响[6-7]。该如何选择有效的消毒药，仍然困扰着很多猪场。近来迫于非洲猪瘟疫情压力，很多猪场都筹建有小型实验室，基本能满足简单的微生物试验以及非洲猪瘟检测的功能。鉴于此，文章就以实验室筛选不同类型的消毒药以及其在非洲猪瘟复产的空猪舍进行现场消毒试验评价，筛选出有效的消毒剂，以期帮助猪场有效消毒，科学防控非洲猪瘟，也为临床简单有效地筛选消毒药提供一种方法[8]。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2019年6—10月，在西南科技大学生命科学与工程学院微生物实验室和四川省绵阳市三台县某一规模化猪场进行。

1.2 材料

1.2.1 消毒药 熏蒸药：复方多聚甲醛粉，含量90%，山东某兽药有限公司生产。

受试药：消毒药A（过氧乙酸，16.0% ～23.0% ），产品批号190346432，广州产品；消毒药B（100 mL∶戊二醛5 g+癸甲溴铵5 g），产品批号20100106，广州产品；消毒药C（癸甲溴铵，50 g/100 mL），产品批号190343272，广州产品；消毒药D（10% 苯扎氯铵+15% 戊二醛），美国产品。

1.2.2 菌种 本次试验所用沙门氏菌和金黄色葡萄球菌由西南科技大学微生物实验室提供。

1.2.3 试验试剂及主要仪器 普通琼脂培养基，杭州微生物试剂有限公司生产；菌落总数测试片：广东达元绿洲食品科技股份有限公司；核酸（RNA/DNA）柱提试剂，宝生物工程（大连）有限公司生产；非洲猪瘟检测试剂，赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产；伯乐荧光定量PCR仪，型号CFX96Touch，美国伯乐Bio-Rad生产；洁净工作台，型号SW-CJ-1FD，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司生产；培养箱，型号SHP-250型，上海三发科学仪器有限公司生产。

1.3 方法

1.3.1 药敏试验 采用牛津杯法对革兰氏阴性菌沙门氏菌和阳性菌金黄色葡萄球菌进行耐药性分析。将所培养的细菌涂在培养皿中，在培养基表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，参考不同厂家提供的消毒药不同稀释比例（1∶100或1∶3 000或1∶10 000）在杯中加入不同稀释度的消毒药液，进行标记后置于37 ℃培养箱中培养16～18 h，观察并测量抑菌圈直径。消毒药敏感度判断标准如下：抑菌圈直径≥15 mm，高度敏感；10 mm＜抑菌圈直径＜15 mm，中度敏感；抑菌圈直径≤10 mm，低敏感；抑菌圈直径≤5 mm，无抑菌作用。

1.3.2 猪舍消毒试验 以四川省绵阳市某一非洲猪瘟阳性猪场进行试验，场内有4个猪舍，分为4个组，即：一舍、二舍、三舍及四舍，提前将猪只清场，进行彻底清洗后，先对猪舍环境进行多点（至少12个点）采样。具体操作：1）采样面积。被采面积＜100 cm2取全部面积，采样面积≥100 cm2，取100 cm2。2）采样方法。棉拭子法：将5 cm×5 cm的标准灭菌规格板放在被检环境表面，用浸有含灭菌生理盐水的棉拭子在规格板内横竖往返均匀涂抹5次，并随之转动棉拭子，可连续采样4×3个规格板面积，折断上半部分，将棉拭子头放入装有30 mL含生理盐水的试管内，采样后马上放入随身携带的冰袋箱内保存，当天对采样棉拭子头滤液进行检测。一部分滤液按照菌落总数测试片的操作说明进行实验室37 ℃微生物培养16～18 h后，测定环境细菌总数；另一部分滤液按照核酸（RNA/DNA）柱提试剂和非洲猪瘟检测试剂的操作说明进行非洲猪瘟荧光定量检测。圈舍环境采样进行非洲猪瘟检测为阴性后，对圈舍进行多聚甲醛熏蒸消毒结合试验用的不同消毒药喷洒消毒；反之，为阳性时，还需要重新进行清洁圈舍，直至圈舍环境采样非瘟检测为阴性，才能对圈舍进行多聚甲醛熏蒸消毒结合试验用的不同消毒药喷洒消毒，具体分组试验设计见表1。消毒24 h后，按照以上的采样方法对各猪舍环境进行采样，同样进行实验室微生物培养测定环境细菌总数以及非洲猪瘟荧光定量检测，最后进行消毒效果评价。

表1 猪舍消毒药使用分组试验设计

1.4 数据处理

所有数据采用IBM SPSS 22软件进行统计分析。

2 结果分析

2.1 药敏结果分析

从表2可以看出，对沙门氏菌来说，在1∶3 000浓度下，消毒药B、消毒药C和消毒药D之间相比，差异不显著（P＞0.05），但消毒药A与消毒药C相比差异显著（P＜0.05）；在浓度为1∶100时，消毒药A与消毒药D比较，差异不显著（P＞0.05），但消毒药A抑菌圈直径最大；在1∶10 000浓度下，消毒药A与消毒药C比较，差异显著（P＜0.05），消毒药A抑菌圈直径最大，整体来说，消毒药A对革兰氏阴性菌沙门氏菌的抑菌效果最好。对金黄色葡萄球菌来说，浓度为1∶100时，消毒药A与消毒药D相比，差异极显著（P＜0.01），消毒药D抑菌圈直径最大，属于高度敏感，杀菌效果最好；在1∶10 000浓度下，消毒药A与消毒药C比较，差异不显著（P＞0.05）；而在浓度为1∶3 000浓度下，消毒药A、消毒药B和消毒药C之间相比，差异不显著（P＞0.05），而消毒药C与消毒药D相比差异显著（P＜0.05），消毒药C的抑菌圈直径最大，消毒药C对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，属于中度敏感。综合分析比较，在浓度1∶3 000时，消毒药A对革兰氏阴性菌和阳性菌抑菌效果较好；在浓度1∶100时，消毒药D对革兰氏阴性菌和阳性菌杀菌效果较好。

表2 不同消毒药不同浓度对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌效果

2.2 不同消毒药对猪舍消毒前后消毒效果分析

从表3可以看出，第1次清洗后进行非洲猪瘟检测呈阳性，然后进行第2次清洗，检测非洲猪瘟呈阴性，第1次清洗与第2次清洗细菌总数平均值相比较，第2次清洗比第1次微生物数量差异极显著（P＜0.01），最大相差10个数量级以上；猪舍采样检测非洲猪瘟呈阴性，清洗符合规定后，正式进行消毒试验。从各组使用的熏蒸和喷洒消毒药组合及消毒前与消毒（24 h）后细菌总数比较来看，猪舍消毒前和消毒后相比较，微生物数量差异极显著（P＜0.01），消毒后各组之间比较，微生物数量差异不显著（P＞0.05），一舍、二舍和三舍的细菌总数在270～370 CFU范围内，而四舍在40 CFU左右，相差近10个数量级，说明消毒药D（1∶100）效果最好，其次是消毒药B（1∶500），消毒药C（1∶1 000）和消毒药A（1∶50）效果差不多。

表3 不同消毒药对不同猪舍消毒前后细菌总数和非洲猪瘟指标变化

2.3 价格比较

由于使用的是厂家推荐的环境消毒的最大剂量来进行消毒，最后得出的结果不同，结合厂家提供的价格平衡性价比来确定是否符合猪场或不同的猪舍使用要求。由表4可知，从效果来，消毒药D效果最好，但价格最贵；从性价比来看，消毒药C可以选择应用。

表4 不同消毒药在猪舍中使用效果及其价格

3 讨论与小结

消毒措施是猪场生物安全体系中的重要环节，在预防和控制传染性疾病方面发挥着重要作用，不仅可以降低猪场环境中病原微生物的数量，而且可降低猪场微生物的污染程度，阻断病原微生物从外部环境传入和在猪群内部的扩散，显著降低了细菌性疾病及病毒性疾病的发生率[9-11]。当前，规模化生猪养殖场在应对防控非洲猪瘟疫情时，没有疫苗可用，没有药物可治，只能采取消灭传染源、切断传播途径的方式进行主动防控，因此科学、系统、高效的消毒显得尤为重要，其中消毒药的正确筛选以及临床上正确使用是关键。

3.1 实验室药敏试验筛选

不同的病原微生物，对消毒药的敏感性有很大的差异。大多数的消毒药对细菌有杀灭作用，但对细菌的芽孢和病毒作用很有限。由于养猪生产中细菌性病原占多数，实验室只需配备有超净工作台和培养箱就可以进行细菌微生物药敏试验。细菌经革兰氏染色分成两类，即革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌。本研究就以选择革兰氏阴性菌猪沙门氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌分别用消毒药A、消毒药B、消毒药C和消毒药D进行药敏试验和抑菌效果评价。从试验的药敏结果来看，在中等浓度（1∶3 000）时，消毒药A对沙门氏菌的抑菌效果最好，即抑菌圈直径为（14.81±0.693） mm，属于中度敏感，而消毒药C对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，即抑菌圈直径为（14.43±1.009） mm，属于中度敏感。从整个表2来看，消毒药A和消毒药D在高浓度（1∶100）下，在沙门氏菌表现出抑菌圈直径≥15 mm，沙门氏菌对消毒药A和消毒药D属于高度敏感；在金色葡萄球菌表现出抑菌圈直径≥15 mm，金色葡萄球菌只对消毒药D属于高度敏感，说明不同类型的消毒药对革兰氏阴性菌和阳性菌敏感性不一样，浓度高时对细菌的抑制较强，高度敏感[12-13]，然而中等浓度时，杀菌强的消毒剂不一定抑菌效果好，因此，在实际应用中应根据消毒的目的来对消毒药类型及浓度进行选择。

3.2 临床上使用消毒剂后消毒效果评价

试验室内对消毒药进行药敏试验评价消毒药效果，由于试验用的病原微生物菌比较单一且裸露在外，而猪场环境中病原微生物的种类复杂，尤其是猪舍内微生物聚集较多，为了进一步验证以上消毒剂在临床上的消毒情况，选择非洲猪瘟复产前空猪舍进行消毒评价，消毒前先对猪舍进行彻底清洗，并对猪舍进行多点（12个点以上）采样，进行微生物培养菌落数，同时检测非洲猪瘟指标是否阳性，只有检测结果为阴性时，才能进行下一步消毒试验。从表3可以看出，一舍和三舍第1次清洗后非洲猪瘟检测呈阳性，同时两个舍细菌总数平均值较另外的非洲猪瘟呈阴性的猪舍细菌总数都高，进行第2次彻底的清洗后，一舍和三舍细菌总数平均值比第1次的细菌总数下降，甚至达10个数量级以上，非洲猪瘟呈阴性，说明彻底的清洗是清除猪舍大部分环境微生物的关键[14-16]，但也不能完全清洗到很低的数量级别，还是需要消毒药来补充由于清洗不到位的部分。现场消毒试验结果表明，消毒药D（1∶100）效果最好，消毒后该猪舍细菌总数比其它3个猪舍低7～10倍，然而消毒药A（1∶50）反而不如消毒药D（1∶100），说明消毒药类型本身决定了消毒效果是否高效。对于消毒药D主要消毒成分为戊二醛苯扎氯铵，主要用于动物厩舍及其器具的消毒，其中戊二醛可杀灭各种微生物（包括细菌的芽孢），属于高效的消毒剂[17]，成本高，作为器械消毒剂效果明显，而作为环境消毒剂则受到成本的限制，醛类属于还原性消毒剂，是通过凝固蛋白质杀灭病菌的，使用浓度大，气味刺鼻，作为消除非洲猪瘟的阳性场，可以考虑使用，它也是农业农村部推荐的防控非洲猪瘟疫情的消毒药。消毒药A主要成分为过氧乙酸，它是一种强氧化剂，可以杀灭大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、白色葡萄球菌等细菌和真菌，属于杀菌能力较强的消毒剂。而消毒药C主要成分是癸甲溴铵，它是一种季铵盐类阳离子表面活性剂，抑菌效果好，可杀灭亲脂病毒和细菌繁殖体，属于低效消毒剂，根据消毒任务和消毒对象用于预防消毒时居多。

综合以上试验结果，兼顾实际使用成本，可以用本研究简单的试验方法来筛选适合不同情况下猪场应用的消毒药及其实际使用浓度。在消毒前要做好彻底的清洗工作，建议猪场如果发生非洲猪瘟疫情时，最好使用高效消毒药进行杀灭病原微生物，质量好的戊二醛类消毒剂，1∶100高浓度使用；平时的常规消毒要选择安全性好、低毒、低刺激等抑菌效果好的中效消毒药，中等浓度使用，再结合市场价格来选择消毒药的产品。