一种新的适用于活体斑马鱼成像观察的固定方法

陈二方 常会敏 安晓刚 邱建华 查定军

摘要 [目的] 建立一种更适用于活体斑马鱼成像的固定方法，为活体斑马鱼成像研究提供技术支持。[方法]通过比较4种不同的斑马鱼体位固定方法及成像观察效果，观察不同固定方法的可操作性和成像观察效果。[结果]使用6%甲基纤维素固定时，对斑马鱼进行拍照时容易产生摆动;使用0.05%MS-222固定时，斑马鱼很难保持合适的体位;使用1%的低熔点琼脂糖，相对费时; 使用6%甲基纤维素/0.05%MS-222固定时，既可以使斑马鱼保持湿润的环境，又可以保持理想的静止状态。[结论]通过比较4种固定方法发现，使用6%甲基纤维素/0.05%MS-222固定斑马鱼仔鱼可操作性最好，该方法可为斑马鱼活体研究提供良好的活体成像观察保障，有助于获取高质量的活体成像图片。

关键词 斑马鱼;活体成像;甲基纤维素;固定方法

中图分类号 S 917.4  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）23-0124-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.033

A New Fixation Method for in vivo Imaging and Observation of Zebrafish

CHEN Er-fang1， CHANG Hui-min2， AN Xiao-gang1 et al

（1.Otolaryngology，Head and Neck Surgery， Xijing Hospital， PLA Air Force Military Medical University，Xi’an， Shaanxi 710032; 2. Department of Otolaryngology，Head and Neck Surgery，The First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University，Xi’an，Shaanxi 710077）

Abstract [Objective] To introduce a new fixation method for in vivo imaging of zebrafish， and provide technical supports for in vivo imaging research of zebrafish.[Method] Though comparing the position fixation methods and imaging observation effects of four different methods， the feasibility and imaging observation effects of different fixation methods were observed.[Result]6% methyl cellulose fixation method was used， it was easy to produce wobble in the process of taking pictures. When zebrafish was fixed with 0.05%MS-222， it was difficult to maintain the proper position.When 1% agarose with a low melting point was used， it was relatively time-consuming. When 6% methyl-cellulose /0.05%MS-222 were used for the fixation， it could not only keep zebrafish in a moist environment， but it could maintain an ideal static state. [Conclusion] By comparing four fixation methods， it was found that fixing zebrafish with 6% methylcellulose /0.05%MS-222 were the most maneuverable.This method could provide a good in vivo imaging observation guarantee for in vivo research of zebrafish， and it was helpful to obtain  in vivo imaging pictures with high-quality.

Key words Zebrafish;In vivo imaging;Methyl cellulose;Fixation method

基金项目 国家自然科学基金面上项目（81870732）;学科助推计划-先进学科建设项目（XJZT18X23）。

作者简介 陈二方（1984—），女，安徽宿州人，技师，硕士，从事耳聋的基础研究。通信作者，教授，博士，从事耳科基础与临床研究。

收稿日期 2021-07-28

斑马鱼作为一种热带鱼，胚胎发育速度快、养殖成本低、能大规模繁育[1-3]。研究发现，斑马鱼基因与人类基因的相似度在70%以上[4]，因此它受到生物学家的重视，已经成为最受重视的脊椎动物发育生物学研究的动物模型之一[5]。目前全球范围内有超过1 500个斑马鱼实验室，我国有300个以上的实验室利用斑马鱼开展相关试验[6]。

斑马鱼体表含有神经丘毛细胞，同时内耳也存在毛细胞，常被用于内耳毛细胞损伤与保护的试验研究中。但是，在斑马鱼动物模型造模過程中，对斑马鱼毛细胞进行特异性染料标记后发现，如何固定斑马鱼使其在激光共聚焦显微镜、体式显微镜下成像观察及拍照、获取高质量的图片尤为重要。笔者通过比较4种活体斑马鱼成像观察的固定方法，尝试找出一种最佳适用于活体斑马鱼成像观察的固定方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

AB品系野生型斑马鱼在中国人民解放军空军军医大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科全军航空航天医学内耳研究重点实验室养育，并进行繁育传代;斑马鱼在28.5 ℃恒温环境中生长，光照∶黑暗时间为14∶10，胚胎用胚胎培养液培养，养殖方法参照《Zebrafish Book》（http：//www.zfin.org）常规方法进行。

1.2 试验材料与设备

试验材料：甲基纤维素（M6385，Sigma）;苯基硫脲（P7629，Sigma）;低熔点琼脂糖（A9414，Sigma）;乙基3-氨基苯甲酸酯甲烷磺酸盐（MS-222，A5040）;氫氧化钠购自天津市天力化学试剂有限公司;突触素TMC4（FM1-43，Sigma，S6814）。主要设备：激光共聚焦显微镜（FV-1000，奥林巴斯，日本）;体式显微镜（M205 FA，莱卡，德国）;精密电子天平（Sartorius，德国）;GZX型光照培养箱（北京中兴伟业）;爱生斑马鱼养殖系统。

1.3 胚胎养殖

在交配前一晚，在交配盒中按照雌雄比1∶1或1∶2配鱼（图1）。交配当日，抽掉交配盒中间的隔离挡板，让雌、雄鱼互相追逐，产下胚胎，并收集胚胎。收集过程中去除死卵及粪便等，将胚胎置于胚胎培养液中，放置在28.5 ℃的光照培养箱中，待发育至24 hpf（hours post fertilization）时，换成0.003%的苯基硫脲（PTU）溶液，其作用是抑制黑色素形成，排除其对活体成像的干扰。

1.4 6%甲基纤维素/0.05% MS-222的配制

将MS-222配制成5%的储存液，使用时浓度稀释至0.05%。将140 mL 0.05% MS-222置于磁力搅拌器上加热至沸腾，将12 g甲基纤维素缓慢加入，一边加入一边用玻璃棒搅拌，以促使其溶解，继续搅拌3 min左右，直至甲基纤维素充分溶解分散，加入3～5滴5 moL/L的NaOH溶液，促使其溶解，在此期间继续搅拌，此时溶液逐渐呈乳白色;将溶液和预先放置在冰箱冷藏室中的60 mL 0.05% MS-222充分混合、预冷，溶液颜色从乳白色变成半透明色，继续将溶液放置在制冰机或者冷冻中，处理2 h左右，溶液变成透明的淡黄色。

1.5 FM1-43染色

首先将FM1-43配制成10 mg/mL的储存液，避光冷冻储存，使用时稀释成浓度3 μmoL/L。将发育至5 dpf（days post fertilization）的斑马鱼仔鱼，置于6孔板上，吸除斑马鱼养殖用水，加入5 mL 3 μmoL/L的FM1-43，避光染色10 min;最后，吸除染液，用斑马鱼养殖用水洗涤3次，每次10 min，采用不同的固定方法将仔鱼固定在共聚焦培养皿或者凹玻片上，显微镜下成像观察及拍照。

2 结果与分析

2.1 4种固定活体斑马鱼方法的比较

用一次性的巴氏吸

管将发育至5 dpf的斑马鱼仔鱼从养殖盒中缓缓吸出，置于凹

玻片或共聚皿上，用滤纸条将多余的水分吸除。使用以下4种固定方法分别固定斑马鱼仔鱼，见表1。①使用巴氏吸管将预先配制好的6%甲基纤维素滴在仔鱼上，用牙探针或镊子将斑马鱼调整至合适的成像体位。甲基纤维素具有一定的黏性，可使鱼体摆放成特定的成像体位，但支撑力度欠缺，在拍照过程中会有轻微摆动，影响拍照效果。②使用移液器将0.05%MS-222吸出，滴加在仔鱼上，用上述同样方法调整体位，仔鱼在麻醉剂的作用下保持静止，但是由于缺乏支撑，很难将仔鱼摆放成适合拍照的体位，且在拍照过程中，由于载物台的移动，体位容易改变。③将配制的1%低熔点琼脂糖冷却至30 ℃以下后，用巴氏吸管吸出，滴在斑马鱼上，用工具调整好体位，等待琼脂糖凝固。该方法的优点是可以给仔鱼提供适宜的湿度及支撑，缺点是此琼脂糖在65 ℃左右会溶解，在26～30 ℃下会凝结，温度不好控制。温度过高时容易造成仔鱼死亡，温度过低时琼脂糖凝结较快，不方便固定。④使用巴氏吸管将6%甲基纤维素/0.05%MS-222滴加在斑马鱼仔鱼上，按照同样方法调整体位。此方法不仅可快速固定斑马鱼仔鱼，而且甲基纤维素提供的湿度可使仔鱼存活相当长的时间。另外，MS-222可使仔鱼麻醉，并保持静止状态，方便成像观察及拍照记录。通过比较上述4种固定方法发现，使用6%甲基纤维素/0.05%MS-22固定斑马鱼仔鱼的方法更具优势，可操作性更强，更适用于活体斑马鱼成像观察。

2.2 甲基纤维素/MS-222联合固定仔鱼结果

将斑马鱼仔鱼包埋在含0.05%MS-222的6%甲基纤维素中，仔鱼可在较长时间内保持相同的姿势，同时甲基纤维素也不会影响成像观察及拍照视野。无论使用激光共聚焦拍照（图2），还是使用体式显微镜拍照（图3），均能取得较满意的拍摄效果。

3 讨论

近年来斑马鱼动物模型常被用于发育、毒理等方面的研究中[7-10]。由于斑马鱼具有与哺乳动物类似功能的内耳结构，且其体表侧线上分布着感受声音、震动及水流等的神经丘毛细胞，所以斑马鱼越来越受到耳科领域研究者的青睐。另外，斑马鱼毛细胞是可以再生的，且具有胚胎产量多、发育快等优点，因此被越来越广泛应用于内耳毛细胞损伤及保护性药物筛选中。Vlasits等[11]利用斑马鱼动物模型，从FDA批准的药物库中筛选出可以保护毛细胞免受顺铂和氨基糖苷类药物损伤的化合物。Namdaran等[12]用新霉素损伤斑马鱼侧线神经丘，建立毛细胞损伤与再生模型，从1 680种化合物中筛选出地塞米松、强的松龙2种可以促进再生的化合物和氟苯达唑、拓扑替康等6种抑制再生的化合物。

然而，在斑马鱼动物模型造模成功后，如何对斑马鱼进行良好的体位固定，以便观察成像及获取理想的图片成为研究学者亟待解决的问题。传统固定活体斑马鱼的方法主要包括：①先用麻药将鱼麻醉，再用甲基纤维素固定[13];②单纯使用鱼麻醉剂（MS-222）麻醉[14];③使用低熔点琼脂糖固定[15]。有些试验研究并未提及使用的具体固定方法。该研究采用4种不同的固定方法，比较其在斑马鱼活

体成像研究中的固定效果，结果发现使用6%甲基纤维素/

0.05%MS-222固定方法较其他3种固定方法更为有效，使

用固定液无须现配现

用，固定仔鱼所需时间短，操作过程中鱼体位不易变化，且仔

鱼不容易震动。这种固定方法可操作性更强，更适用于活体斑马鱼成像观察，为活体斑马鱼成像观察研究建立了一种新方法。

参考文献

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