不同养殖地区日本医蛭的生长及抗凝血活性研究

蒲德成 曹敏 余米

摘要 [目的]探究不同养殖地区日本医蛭的生长和抗凝血活性。[方法]以野外捕获（江苏）的日本医蛭为对照组，以重庆、广西、广东养殖的日本医蛭为试验组，进行人工养殖试验。[结果]日本医蛭能在不同地区进行人工驯养;人工养殖的日本医蛭最低存活率为（73.50±0.51）%，120日龄最低体重为（2.984 3±0.022 1） g，与野外捕获的日本医蛭体重存在显著差异。日本医蛭在出苗30 d内体重增长率最大，死亡率最高，均随着养殖时间的延长而降低。人工养殖日本医蛭的抗血凝活性为168 U/g，与野生日本医蛭（275 U/g）存在显著差异。[结论]日本医蛭能在不同地方引种养殖，且其抗凝血活性能达到《中国药典》规定标准。

关键词 日本医蛭;人工养殖;成活率;抗凝血活性

中图分类号 S 917.4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）23-0121-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.032

Study on the Growth and Anticoagulant Activity of Hirudo nipponia in Different Cultivation Areas

PU De-cheng1，CAO Min2，YU Mi2

（1.Agricultural and Rural Committee of Wuxi County， Chongqing 405899;2.Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation， Chongqing 408435）

Abstract [Objective] To study the growth and anticoagulant activity of Hirudo nipponia in  different culture areas.[Method] H.nipponia captured in the field （Jiangsu）  was used as the control group， the artificial culture experiment was carried out in Chongqing， Guangxi and Guangdong.[Result] H.nipponia could be artificially raised in different regions.The lowest survival rate of H.nipponia  cultured artificially was （73.50±0.51）%，  the lowest body weight at 120-day-age was （2.984 3±0.022 1） g， there was significant difference  of  the body weight  between cultured and captured H.nipponia.The relative growth rate of body weight and mortality rate of H.nipponia were the highest within 30 days  after emergence， which decreased with prolonging of cultivation time. The anticoagulant activity of cultured H.nipponia was 168 U/g，which was significantly different from that of wild H.nipponia（275 U/g）.[Conclusion] H.nipponia could be introduced and cultured in different regions， and its anticoagulant activity could meet the standard stipulated in China Pharmacopoeia.

Key words Hirudo nipponia;Artificial culture;Survival rate;Anticoagulant activity

基金項目 重庆市科学技术局项目（cstc2018jxjl-jbky00003，cstc2019jscx-msxmX0357）;重庆市卫健委“药用动物学”重点学科建设项目;重庆市生态渔产业技术体系建设专项。

作者简介 蒲德成（1980—），男，四川南充人，高级工程师，硕士，从事名优水生动物保种开发及技术推广工作。通信作者，助理研究员，硕士，从事药用水生动物养殖开发利用研究。

收稿日期 2021-07-20

日本医蛭（Hirudo nippnica）别名水蛭、稻田蛭，隶属无吻蛭目（Arhynchobdellida）医蛭科（Hirudinidae）医蛭属（Hirudo），模式产地为日本，国内主要分布在北方，在西南地区亦有分布[1]，是我国心脑血管疾病治疗药物的主要原料。由于心脑血管疾病治疗药物的研发，对日本医蛭的需求逐年增加，加上环境的改变，原本丰富的日本医蛭资源现已不能满足国内的需求，开展人工养殖势在必行。

国内有关日本医蛭的研究主要集中在养殖和繁殖上[2-4]，有关日本医蛭的生物学特性与肠道微生物等领域[5-7]研究亦有报道，而其抗凝血活性则一直是研究的热点[8-10]。但是，有关不同地区养殖日本医蛭的对比研究还未见报道。笔者在不同养殖地区开展养殖试验，比较了野生与人工养殖日本医蛭的体重、存活率以及不同地区的抗凝血活性差异，以期为日本医蛭的人工养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

日本医蛭野外样本于2018年9月下旬收集于江苏沛县，共捕获2 586条，随机抓取258条，用滤纸吸掉日本医蛭体表水分，进行体重测定;重庆、广东、广西组日本医蛭均采用重庆南川基地人工繁殖培育的日本医蛭幼苗。

1.2 饲喂方法

采用长125 cm、宽80 cm、高75 cm的聚氯乙烯（PVC）水产养殖箱进行养殖，箱体水深8 cm，养殖水温控制在28～30 ℃，养殖密度为1 000条/m2，设3 个重复组;每天07：00—09：00换水，每7 d投喂猪血1次，投喂量为医蛭体重的200%。

1.3 测定方法 每隔30 d随机抽样50条，测定日本医蛭体重（投喂前1 d测量体重），分别计算增重率和存活率。抗凝血活性的测定采用凝血酶滴定法[11]。

存活率（%）的计算公式如下：

r=aN×100%（1）

式中，r为各时期的存活率（%），a为各个时期的存活数，N为试验开始时总个数。

体重增长率（%）的计算公式如下：

ΔW=WT-WT-1WT-1×100%（2）

式中，ΔW为体重增长率（%），T表示日龄，WT表示T日龄测量的体重，WT-1表示（T-30）日龄测量的体重。

记录消耗凝血酶溶液的体积，按照以下公式计算：

U=C1V1C2V2（3）

式中，U为每 1 g 供试品含凝血酶活性单位（U/g），C1为凝血酶溶液的质量浓度（U/mL），C2为供试品溶液的质量浓度（g/L），V1为消耗凝血酶溶液的体积（μL），V2为供试品溶液的加入量（μL）。

1.4 数据统计与分析 试验数据均以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析进行差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 野外日本医蛭体重分布 对野外采集日本医蛭的体重分布进行分析，结果见图1。从图1可以看出，野生日本医蛭体重集中分布在>0.10～0.20 g，占比62.3%;其次为>0.20～0.25 g和>0.05～0.10 g，占比分别为15.0%和11.9%;体重大于0.25 g的日本医蛭仅占8.5%。

2.2 不同养殖地日本医蛭体重与存活率

从表1可以看出，

1～120 d人工养殖日本医蛭的体重逐渐增加，存活率逐渐降低。野生与人工养殖的日本医蛭体重存在明显差异，且人工养殖的日本医蛭最低体重（重庆）是野生日本医蛭的17.01倍。3个养殖场中，广东养殖日本医蛭的体重最大，达到（4.605 0±0.023 8）g。重庆、广西、广东地区日本医蛭体重增长率的变化趋势基本一致，均随日龄的增加而下降;广东、广西、重庆地区30 d日本医蛭的体重增长率分别为2 693%、2 389%和1 744%;30～120 d日本医蛭的体重增长率明显趋缓。各养殖场在30 d时日本医蛭的死亡率均最大，分别为10.99%、20.80%和22.80%;30～120 d日本医蛭的死亡率趋于平缓（图2）。

2.3 不同养殖地区日本医蛭抗凝血活性

从图3可以看出，日本医蛭的抗凝血活性均高于《中国药典》规定标准，其中野生日本医蛭（江苏）的抗凝血活性最高（275 U/g），与其他养殖地区均存在显著差异（P<0.05）;人工养殖的日本医蛭中，重庆地区日本医蛭的抗凝血活性最高（225 U/g），与广西和广东地区存在显著差异（P<0.05），广西、广东地区养殖的日本医蛭抗凝血活性分别为168和175 U/g。

3 讨论

3.1 日本医蛭养殖中影响成活率的因素分析

不同养殖

用水水质指标与水生动物的生长密切相关。水体pH过高或过低不仅影响水生动物幼苗的消化酶活性[12]、发育进程[13]，而且影响其存活率[14]。水体的硬度过高或过低会对水生生物的繁殖和幼苗存活产生不利影响[15-16]，也有研究表明高硬度

注：相同小写字母表示差异不顯著（P>0.05）;不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

Note： The same lowercase letters indicated no significant difference （P>0.05）; different lowercase letters indicated significant difference （P<0.05）

图3 不同养殖地区日本医蛭抗凝血活性

Fig.3  The anticoagulant activity of H.nipponia in different farming areas

水有利于七彩神仙鱼幼鱼的生长发育[17]。此外，一定浓度内的Ca2+、Mg2+能有效降低重金属对浮游植物、动物的毒性[18-19]，从而达到保护水生生物的目的。水体中氨氮含量过高不仅会导致水生生物氨氮中毒，而且会使水生生物体将大部分的能量用于机体消耗，从而导致饲料转化率下降[20]，甚至会降低水生生物幼苗的存活率[21]。因此，养殖水体的水质可能会影响日本医蛭幼苗的存活率。该试验发现日本医蛭原生地水域和养殖地用水的氨氮含量及Ca2+、Mg2+浓度均较高，推测日本医蛭喜高钙镁离子水体，且对水体中氨氮具有一定的耐受力。结合试验地水质指标分析，广西、广东地区日本医蛭幼苗存活率低与水体中氨氮含量过高有一定的关系。

3.2 日本医蛭的抗凝血活性

目前抗凝血活性测试方式主要有生物活性测定法、免疫测定法和化学测定法[22]，其中生物活性测定法测试方式较多、操作简单，但是受凝血酶纯度的影响较大。影响药用类水蛭抗凝血活性的因素很多，例如吸血类高于非吸血类[23-24]，水蛭头部明显高于其他部位[25-26]，鲜品水蛭的抗凝血活性明显高于干品。野生水蛭抗凝血活性较高的主要原因可能是其体重较轻，相较于人工养殖的日本医蛭，其一直处于“饥饿”状态，水蛭素分泌较多，其活性处于较高水平。

综上所述，人工养殖日本医蛭可作为药用材料来源，在幼苗期间应特别注意加强养殖水质管理来提高幼苗存活率。

参考文献

[1]杨潼.中国动物志：环节动物门 蛭纲 [M].北京：科学出版社， 1996.

[2] 金仕勇， 陈仕江.日本医蛭适宜饲养密度的研究[J].重庆中草药研究，2003（1）：12-13.

[3] 石萍， 鲁增辉， 贺元川， 等.水蛭（日本医蛭）繁殖性能的研究[J].中药材， 2015，38（6）：1144-1147.

[4] 陈仕江， 金仕勇， 李黎.光合细菌净化日本医蛭养殖水体的研究[J].中药材， 2001， 24（5）：323-324.

[5] 余米，刘嘉，周梦，等.日本医蛭生境水质及生物学特性初探[J].中药材，2019，42（12）：2782-2785.

[6] 石萍， 鲁增辉， 游华建， 等.饥饿及恢复喂食对日本医蛭肠道菌群多样性的影响[J].水生生物学报， 2019， 43（3）：537-544.

[7] 陈亚莉，王贵虎，张全星，等.水蛭肠道微生物的研究进展[J].安徽农业科学，2015，43（15）：164-166.

[8] 程珊， 汪波， 肖凌， 等.基于蛋白免疫印迹的水蛭抗凝活性成分研究[J].世界科学技术-中医药现代化， 2019，21（4）：657-661.

[9] 丁钊， 肖凌， 龚元， 等.日本医蛭冻干粉的质量标准研究[J].中国药房， 2018，29（9）：1237-1241.

[10] 張和韡， 王丽萍.水蛭素的研究进展[J].中国中西医结合肾病杂志， 2013， 14（1）：76-78.

[11] 陈华友， 邢自力， 李媛媛，等.凝血酶滴定法测定水蛭素活性的改进[J].生物技术， 2002， 12（6）：24-25.

[12] 罗奇，区又君，艾丽，等.温度和pH对条石鲷幼鱼消化酶活力的影响[J].热带海洋学报，2010，29（5）：154-158.

[13] 张甫英， 李辛夫.低pH对鱼类胚胎发育、鱼苗生长及鳃组织损伤影响的研究[J].水生生物学报，1992，16（2）：175-182，196.

[14] 强俊， 李瑞伟， 王辉.pH对奥尼罗非鱼仔鱼活力及仔、稚鱼生长的影响[J].南方水产，2009，5（2）：69-73.

[15] 陈亚琴.水质硬度和pH值对神仙鱼繁殖的影响[J].水利渔业， 2006， 26（4）：54，77.

[16] 郑曙明， 吴青， 李玉宏， 等.pH和硬度对曼龙鱼孵化率和稚鱼成活率的影响[J].水利渔业， 1999（1）：6-7.

[17] 邵邻相， 叶菲菲.水硬度对七彩神仙鱼幼鱼发育的影响[J].水产养殖， 2005， 26（3）：40-42.

[18] CHARLES A L，MARKICH S J，STAUBER J L，et al.The effect of water hardness on the toxicity of uranium to a tropical freshwater alga （Chlorella sp.）[J].Aquatic toxicology， 2002， 60（1/2）：61-73.

[19] YIM J H，KIM K W，KIM S D.Effect of hardness on acute toxicity of metal mixtures using Daphnia magna.Prediction of acid mine drainage toxicity[J].Journal of hazardous materials， 2006， 138（1）：16-21.

[20] 李波， 樊启学， 杨凯， 等.慢性氨氮胁迫对黄颡鱼摄食、生长及血液指标的影响[J].应用与环境生物学报， 2011， 17（6）：824-828.

[21] 黄厚见.摄食水平、氨氮胁迫对梭鱼幼鱼生长的影响及其毒理效应研究[D].上海：上海海洋大学， 2012.

[22] 李冰宁， 欧阳杰， 武彦文，等.水蛭素检测方法研究进展[J].药物分析杂志， 2010，30（4）：755-760.

[23] 吴志军， 张灵霞， 于立华.四种不同品种水蛭生物活性的研究与比较[J].中成药， 2006， 28（2）：232-234.

[24] 李军， 于翔， 张健，等.4种水蛭粗提物抗凝活性及冻存时间对菲牛蛭抗凝活性影响[J].水产科学， 2014，33（9）：591-593.

[25] 汪文茉， 张秋海， 欧兴长.水蛭头、尾抗凝活性的比较及晾干后对活性的影响[J].中国中药杂志， 1998，23（3）：176.

[26] 刘君， 张丽艳.蚂蟥药材头部与尾部抗凝活性比较研究[J].长春中医药大学学报， 2014， 30（3）：407-408.