消毒方式对绿豆愈伤组织培养的影响

2021-12-18王珅范保杰王彦曹志敏苏秋竹张志肖刘长友田静

安徽农业科学 2021年23期

王珅范保杰王彦曹志敏苏秋竹张志肖刘长友田静

摘要为明确绿豆愈伤组织培养体系中最佳种子消毒方式，利用乙醇、次氯酸钠（NaClO）、氯化汞（HgCl2）和氯气（Cl2）作为消毒剂，组合搭配16种消毒方式对绿豆种子进行消毒处理。对发芽率、污染率、种皮破损率及愈伤组织诱导率等指标进行综合评价分析。结果表明，75%乙醇 30 s+1.0% NaClO 10 min的消毒方式处理的绿豆种子发芽率为90.11%，该处理无污染，种皮无破损，出愈率达到92%，诱导的愈伤组织呈黄绿色块状，结构紧密且质地硬，生长速率与生长状况良好。因此，该消毒方式适用于绿豆愈伤组织培养过程中的种子消毒，且有利于绿豆子叶节的愈伤诱导。

关键词绿豆;种子;消毒方式;愈伤诱导

中图分类号 S 522 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2021）23-0029-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.008

Effects of Different Disinfection Methods on Callus Culture of Mung Bean（Vigna radiata）

WANG Shen， FAN Bao-jie， WANG Yan et al

（Institute of Cereal and Oil Crops， Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Hebei Laboratory of Crop Genetic and Breeding， Shijiazhuang， Hebei 050035）

Abstract In order to determine the best disinfection method of mung bean seeds in callus culture system， 16 disinfection methods were used to disinfect mung bean seeds with ethanol / NaClO / HgCl2 and chlorine as disinfectants. In addition， the germination rate， pollution rate， seed coat damage rate and callus induction rate were comprehensively evaluated and analyzed. The results showed that the germinating rate of mung bean seeds treated with 75% ethanol for 30 s+1.0% NaClO for 10 min was 90.11%， and there was no pollution， the seed coat was not damaged， the callus induction rate was 92%， and the callus was light yellow green， compact in structure and hard in texture. Therefore， this method was suitable for seed disinfection in the process of mung bean callus culture and is conducive to the callus induction of mung bean cotyledon node.

Key words Mung bean;Seed;Disinfection method;Callus induction

基金項目国家重点研发计划项目（2019YFD1000700/2019YFD1000703）;河北省农林科学院粮油作物研究所青年创新基金课题（2020LYS02）;国家食用豆产业技术体系（CARS-08）;河北省现代产业技术体系杂粮杂豆创新团队（HBCT2018070203）;河北省农林科学院创新工程（2019-4-2-8）。

作者简介王珅（1986—），男，河北石家庄人，助理研究员，硕士，从事绿豆遗传育种研究。通信作者：田静，研究员，硕士，从事绿豆遗传育种研究;刘长友，副研究员，博士，从事绿豆遗传育种研究。田静和刘长友为共同通信作者。

收稿日期 2021-03-24

绿豆[Vigna radiata（Linn.）Wilczek]古名菉豆、植豆，属豆科（Leguminosae），蝶形花亚科（Papilionoideae），豇豆属（Vigna）。富含蛋白质及多种抗氧化活性物质，在现代饮食结构中具有平衡膳食、清热解毒、消暑利水等作用[1-2]。绿豆作为一种小宗杂粮作物，系统选育、杂交选育及辐照育种等常规方法仍是绿豆育种的主要手段。鉴于常规育种局限性与生物技术的快速发展，有必要对绿豆开展转基因育种研究。再生体系建立是利用基因工程技术进行品种改良的重要环节，合适的消毒方式对于高效再生体系建立具有重要影响。

植物组织再生过程中常见消毒方式包括75%乙醇消毒法、次氯酸钠消毒法、氯气消毒法和氯化汞消毒法。吴鹏飞等[3]研究发现，75%乙醇消毒30 s对草莓花药愈伤组织诱导效果较好。陈华涛等[4]利用1%、3%、5%次氯酸钠对小豆种子分别进行10、20、30 min消毒处理，发现单一浓度次氯酸钠随处理时间延长消毒效果增强，且次氯酸钠浓度升高也可提高消毒效果。陈新等[5]在建立小豆组织再生体系中利用了75%乙醇+5%次氯酸钠的消毒方式。大豆再生体系中多采用氯气消毒法。刘银等[6]研究发现，氯气消毒处理后的大豆种子萌发率达100%且污染率为0;李海燕等[7]也认为，氯气对大豆种子消毒效果较好;刘海坤[8]通过研究不同时间氯气处理对大豆种子消毒效果的影响，发现1～24 h氯气消毒效果差异不大，消毒时间太长可能对种子伤害较大从而影响种子活力。范淑芳[9]采用75%乙醇+0.1%氯化汞对华中枸骨新梢茎段进行外植体消毒，获得较好的消毒效果，该消毒方式对后期愈伤组织的形成与生长较好。氯化汞消毒法在豇豆[10]与菜豆[11]组织培养技术研究中为主要消毒方式，但绿豆组织培养体系中消毒方式还不明确。鉴于此，笔者针对绿豆消毒方法展开系统试验，探讨不同消毒方式对绿豆愈伤组织培养的影响，以期找到最佳消毒方式。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验品种选用保绿942-34，由河北省农林科学院粮油作物研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理。选取健康、饱满、无破损、大小均匀的绿豆种子置于烧杯中，将杂质漂洗干净后放入超净工作台，参照已报道文献[3-10]设置16种消毒方式（表1）。消毒处理后均用无菌水冲洗6次，洗去残留消毒剂。

1.2.2

种子发芽。将消毒处理后的种子接种到MS基础培养基中，每个培养皿接种30粒，封口膜封好后置于16 h光照/8 h黑暗的培养室中26 ℃培养5 d。每种消毒处理后的种子接种10皿，重复3次，统计污染率及无菌发芽率。

1.2.3 外植体制备。根据1.2.2的试验结果，选用消毒效果好的O和P方式处理的绿豆幼苗，切除初生叶，取带有3～5 mm上、下胚轴的子叶节作为外植体，接种在愈伤诱导培养基（MS+2，4-D 4 mg/L+6-BA 1 mg/L）上，每皿接种5～7个，设3次重复，14 d后统计出愈率。

1.3 数据统计与分析

发芽率=发芽种子数/接种种子数×100%

污染率=污染种子数/接种种子数×100%

无菌发芽率=无菌发芽种子数/接种种子数×100%

种皮破损率=种皮破损种子数/接种种子数×100%

出愈率=愈伤组织数/接种外植体数×100%。

采用Excel和DPS（v18.10高级版）软件进行数据统计与分析;采用Duncan氏法对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式处理对绿豆污染率与发芽率的影响

2.1.1 单独消毒方式效果评价。

利用消毒方式A、B、C处理绿豆种子，培养5 d后种子发芽率均超过85%;种子污染率分别为64.11%、62.67%、62.33%。这表明单独使用75%乙醇处理即使延长消毒时间也不能有效降低污染率，因此单独使用75%乙醇处理不能获得良好消毒效果。

利用消毒方式D、E、F、G、H、I、J、K、L处理绿豆种子，即浓度为1.0%、2.5%、5.0%次氯酸钠分别处理绿豆成熟种子10、20、30 min都可有效灭菌，污染率均为0。但是随着浓度升高以及处理时间延长会使发芽率降低（表2）。同一浓度次氯酸钠随着消毒时间延长绿豆种皮破损率明显提升（表3）。种皮结构破坏后导致种子活性降低，影响发芽率。种皮破损的绿豆培养5 d后，发芽速率与生长状态明显低于正常绿豆（图1）。

利用消毒方式M、N处理绿豆种子，结果显示氯气消毒效果较好，但绿豆发芽率却显著下降（表4）。原因可能是氯气造成绿豆伤害，使其活性降低，随着处理时间延长，伤害加重，从而导致发芽率降低。

单独使用75% 乙醇（污染率高）或单独使用NaClO（发芽率较低）都无法取得理想消毒效果。氯气消毒导致绿豆发芽率显著降低（46.33%）。

2.1.2 复合消毒方式效果评价。

利用复合消毒方式O和P，即75%乙醇30 s+1.0% NaClO 10 min与75%乙醇30 s+1% HgCl2 10 min均能够达到污染率为0的理想消毒效果，消毒方式O的种子发芽率显著高于消毒方式P（表5），且培养3 d后种子发芽速率与生长状况明显优于消毒方式P（图2）。

该研究显示，复合消毒方式对绿豆种子损伤效果较小，并且种子发芽率显著高于单独消毒方式（图3）。

2.2 复合消毒方式对绿豆愈伤诱导的影响

采用消毒效果较好的O和P复合消毒方式处理后的绿豆种子，培养5 d后切取子叶节接种在愈伤诱导培养基（pH≈5.8）上。结果表明，在相同培养条件下O消毒方式处理后的子叶节愈伤组织诱导率较高，为92.5%，P消毒方式处理后的子叶节出愈率为80.0%。此外，经过O消毒方式处理后的愈伤组织呈黄绿色块状，结构紧密且质地硬，其生长速率与生长状况优于P消毒方式（图4）。

P消毒方式处理后的子叶节在愈伤组织诱导过程中出现了褐化现象（图5），愈伤褐化率11.67 %，O消毒方式没有出现褐化的愈伤。

2种复合消毒方式消毒效果相同，但P消毒方式不足之处在于发芽率与出愈率明显低于消毒方式O，原因可能是消毒过程中氯化汞对外植体产生毒害作用，导致愈伤诱导率降低，这与陶兴魁等[12]对蓝莓外植体消毒方法比较的研究结果相近。综上可知，75%乙醇30 s+1.0% NaClO 10 min更有利于绿豆子叶节诱导愈伤组织，是绿豆愈伤组织培养较为理想的消毒方式。

3 讨论

发芽率能够反映不同消毒方式处理后的绿豆种子活性，种子活性会影响到外植体质量，进而影响出愈率。研究发现，单一的次氯酸钠消毒方式随着浓度升高，发芽率明显降低。氯气有较强消毒效果，李海燕等[7]使用氯气消毒法可对大豆成熟种子消毒且成功获得再生大豆幼苗。在该研究中氯气虽然能够有效去除绿豆种子表面微生物，但发芽率显著降低，这与陈华涛等[4]对小豆种子消毒方法研究结果一致。

消毒效果直接影响绿豆愈伤组织培养，单一的75%乙醇消毒处理时即使时间延长也不能获得理想的无菌种子。浓度为2.5%及5.0%的次氯酸钠处理10 min可有效除菌，但会对绿豆种皮产生较大伤害，加剧了种子活性损伤，导致发芽与生长速率降低。1%次氯酸钠处理后的绿豆消毒效果较好，且发芽率较高，但随着1%次氯酸钠作用时间延长，发芽率降低，其原因可能是绿豆种皮较薄，对次氯酸较为敏感，因此消毒作用时间控制在10 min既能达到良好消毒效果又不会损伤绿豆活性。

植物离體组织培养体系中外植体消毒方式多种多样，选择合适种子消毒方式是获得大量无菌外植体的基础。消毒方式选用原则是获得无菌效果且不影响愈伤组织的诱导。该研究通过比较各种消毒方式处理后的污染率、发芽率、出愈率及愈伤组织效果发现，75%乙醇+1.0% NaClO处理后的绿豆消毒效果好，发芽率与出愈率较高，愈伤组织效果较好。与75%乙醇+1.0% HgCl2消毒方式相比，有以下优势：①对绿豆伤害小，保证高发芽率的同时愈伤组织诱导效果好;②易于采购，使用后的废液对环境相对友好;③实验人员操作安全，实验室安全风险低。因此，在构建绿豆愈伤组织培养体系时，75%乙醇30 s+1.0% NaClO 10 min是一种较好的种子表面消毒方式。

参考文献

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