饲粮大麦粉碎粒度对湖羊瘤胃微生物组成及肌肉脂肪酸的影响

马晓文 ，李发弟 ，2，李飞 *，郭龙

（1. 兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州730020；2.甘肃省肉羊繁育生物技术工程实验室，甘肃民勤733300）

共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是包括共轭双键的十八碳二烯酸同分异构体组成的混合物［1］。诸多学者研究表明，CLA 具有抗癌［2］、抗糖尿病［3］、抗高血压［4］、抗动脉粥样硬化［5］、提高机体免疫机能和改变脂代谢［6］等众多优点。人类摄入的CLA 主要来源于反刍动物的肉和乳。CLA 可通过十八碳二烯酸经反刍动物瘤胃微生物溶纤维丁酸弧菌生物加氢合成［7］。Martin 等［8］和 Kalscheur 等［9］在体外（in vitro）和体内（in vivo）研究均发现低的瘤胃pH 值会导致瘤胃微生物区系发生改变进而降低多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的生物加氢过程。同时，瘤胃中一些微生物数量发生改变，尤其是对pH 较敏感的纤维分解菌，随着瘤胃pH 降低，瘤胃纤维分解菌如产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌的数量会快速减少［10］。而瘤胃pH 值主要受饲粮中瘤胃可降解淀粉含量的影响，进而影响瘤胃中的生物氢化［11］及肌肉脂肪酸的含量。大麦（Hordeum vulgare）作为一种常见的谷物来源，其在瘤胃中的降解速率高于玉米（Zea mays），但降解过快会改变瘤胃微生物区系，甚至造成瘤胃酸中毒等健康问题，而谷物加工处理方式能够影响谷物淀粉在瘤胃的降解率［12］，进而改变瘤胃微生物区系以及肌肉脂肪酸的合成。因此，本试验通过将大麦进行不同粒度的粉碎，改变瘤胃可降解淀粉的含量，探究大麦不同粉碎粒度对瘤胃微生物区系组成及其肌肉脂肪酸含量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验饲粮

参照我国农业行业《肉羊饲养标准》（NY/T 816-2004）［13］，试验饲粮配制能够满足（30.00±0.20）kg，平均日增重250 g 断奶湖羊的营养需要。饲粮组成及营养成分见表1。

表1 试验饲粮组成及营养成分Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.2 试验设计与动物

于2019 年5-9 月，在兰州大学草地农业科技学院民勤试验基地开展试验。选用54 只平均体重为（29.70±1.70）kg 的断奶湖羊公羔，随机分为3 个处理，每个处理18 个重复，每个重复1 只羊。大麦分别经过2、3 和4 mm筛片粉碎，然后与其他饲料原料混匀后制成全混合颗粒饲粮。整个试验期包括：预饲期7 d，正试期63 d 和采样期1 d。

1.3 饲养管理

试验开始前，对羊舍和试验场地进行严格清洁和消毒，试验羊按照免疫程序严格注射疫苗、驱虫及布病检测。所有羊进行单栏饲养，于每日08：00 和18：00 饲喂，自由采食和饮水，定期消毒和清洁卫生。

1.4 指标测定与方法

1.4.1 血液指标的测定 正试期结束后，每组随机选择10 只体况相近的羊，晨饲前在颈静脉处，用采血针采集全血置于2 mL 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，上下轻微颠倒，使抗凝剂与血液充分混匀，防止凝固，在2 h 内完成血常规分析。参考周文静［15］的方法，用全自动血细胞分析仪（IDEXX，ProCyte DX，USA）测定血液中的红细胞总数（red blood cells，RBC）、血红蛋白浓度（hemoglobin concentration，HGB）、红细胞压积（hematocrit，HCT）、平均血小板体积（mean platelet volume，MPV）、血小板总数（platelets，PLT）、白细胞总数（white blood cells，WBC）、淋巴细胞计数（lymphocyte，LYMPH）、单核细胞计数（monocyte，MONO）、嗜酸性粒细胞计数（eosinophil，EO）、嗜中性粒细胞计数（neutrophil，NEUT）、嗜碱性粒细胞计数（basophil，BASO）、平均红细胞血红蛋白浓度（mean red blood cell hemoglobin concentration，MCHC）、平均红细胞体积（mean red blood cell volume，MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（mean red blood cell hemoglobin content，MCH）、红细胞分布宽度标准差（standard deviation of red blood cell distribution width，RDW-SD）、红细胞分布宽度变异系数（coefficient of variation of red blood cell distribution width，RDW-CV）等血常规指标检测动物机体健康状态。

1.4.2 瘤胃微生物DNA 的提取和分析 在正试期结束后，每组随机选取10 只羊在晨饲后3 h 进行屠宰，屠宰后采集瘤胃内容物于50 mL 冻存管中，立即置于液氮中进行速冻，后置于-80 ℃冰箱保存用于瘤胃微生物DNA的提取分析。参照试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，佐治亚州，美国）的说明书进行瘤胃内容物微生物DNA 的提取，通过荧光定量仪（Bio-Rad Laboratories，赫拉克勒斯，美国）对普雷沃氏菌、反刍兽新月形单胞菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌和总菌进行荧光定量分析。反应在96 孔荧光定量板中进行，反应体系为 20 μL，其中包括：10 μL SYBR Green Ⅱ，7.8 μL ddH2O，0.6 μL 上下游引物和 1 μL 瘤胃微生物DNA。扩增反应步骤为：94 ℃预变性 3 min，循环 1 次；94 ℃变性15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，此过程循环40 次；72 ℃终延伸 5 min，循环 1 次。并使用特定 16S rDNA 标准品对各个细菌进行绝对定量［16］。参照金迪［17］的方法计算所有细菌的拷贝数。引物序列见表2［18-23］。

1.4.3 饲粮及肌肉脂肪酸的提取分析 屠宰时采集每只羊的背最长肌200 g，真空密封包装置于-20 ℃保存。肌肉脂肪酸提取前，用冷冻干燥机（SCIENTZ-10ND，宁波）冻干粉碎后称取0.2 g 肌肉样，提取方法参照兰贵生［24］。利用气相色谱仪（TRACE 1300，赛默飞，米兰，意大利）分析各脂肪酸含量，选用SCION-FAME（100 m×0.25 m×0.20 μm，赛恩，新西兰）色谱柱，测定条件为：进样量1 μL，分流比为50∶1，进样口和检测器温度分别为240 和 250 ℃，空气、氢气和补偿气（氮气）的流率分别为 400、40 和 20 mL·min-1，50 ℃持续 4 min，然后以 13 ℃·min-1升至 175 ℃持续 27 min，再以 3 ℃·min-1升至 215 ℃持续 27 min，37 种标准脂肪酸甲基酯样品（37 FAME 标准品，色谱科，美国）和OBCFA 标准品（BR2，Larodan Fine Chemicals，马尔默，瑞典），并用二十一烷酸甲酯作为内标进行样品中脂肪酸的测定与分析。随机采集3 个处理组的饲料样各20 g，饲料样脂肪酸提取和分析方法同肌肉样，饲料样脂肪酸组成见表3。

表3 试验饲粮的脂肪酸组成Table 3 Fatty acid composition of the experiment diets（g·kg-1）

1.5 数据处理与分析

用Excel 2019 整理数据，用IBM SPSS Statistics 25.0 进行单因素 ANOVA 分析，采用 Duncan 法进行多重比较，其中P＜0.05 表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著，0.05≤P＜0.10 表示有显著的趋势。

2 结果与分析

2.1 饲粮大麦粉碎粒度对湖羊血液指标的影响

羊血液的 RBC、HGB、HCT、MPV、PLT、WBC、LYMPH、MONO、EO、NEUT、BASO、MCHC、MCV、MCH、RDW-SD 和RDW-CV 在不同处理间均无显著差异（P＞0.05）（表 4）。

表4 饲粮大麦粉碎粒度对湖羊血液指标的影响Table 4 Effects of barely particle size in diets on blood indexes of fattening Hu sheep

2.2 饲粮大麦粉碎处理对湖羊瘤胃微生物区系的影响

大麦4 mm 粉碎组总菌和溶纤维丁酸弧菌数量显著高于3 mm 粉碎组（P＜0.05），反刍兽新月形单胞菌数量显著低于2 和3 mm 粉碎组（P＜0.05），产琥珀酸丝状杆菌数量显著高于2 mm 粉碎组（P＜0.05）。普雷沃氏菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量各组差异不显著（P＞0.05）（表5）。

表5 饲粮大麦粉碎粒度对瘤胃微生物组成的影响Table 5 Effect of barely particle size in diets on rumen microorganisms composition（lg 16S rRNA copy number·g-1 rumen microbial）

2.3 饲粮大麦粉碎粒度对育肥湖羊肌肉脂肪酸的影响

大麦 4 mm 粉碎组中的 C10：0、C12：0、C14：0 和 C14：1 的含量均显著高于 2 mm 粉碎组（表 6），C18：2n-9t11t和 CLA 的含量显著高于 3 mm 粉碎组（P＜0.05）。anteisoC15：0、C16：1、C18：2n6t 和 C18：2n-9c11t 的占比随着粉碎粒度的增加有增加的趋势（0.05≤P＜0.10）。

表6 饲粮大麦粉碎粒度对育肥湖羊肌肉脂肪酸的影响Table 6 Effect of barely particle size in diets on muscle fatty acid composition of fattening Hu sheep

续表Continued Table

3 讨论

3.1 饲粮大麦粉碎处理对育肥湖羊血液指标的影响

血液成分的变化代表着动物健康状态，能够反映部分疾病［25］。饲喂高谷物饲粮能显著提高反刍动物的生产性能，同时也会使瘤胃可降解淀粉含量增加，引起亚急性瘤胃酸中毒（subacute rumen acidosis，SARA），进而引起机体炎症反应［26-28］，且本试验大麦淀粉在瘤胃中降解速度快，更易造成动物机体患病［29］。因此，血常规的检测是有必要的，本研究结果显示血常规指标均在正常参考范围内［15］。白细胞能够反映动物的免疫能力，包括单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞［30］，对于维持正常的血液循环和疾病诊断有重要的意义［31］。本试验结果显示，3 组间血液WBC、MONO、EO、NEUT 和LYMPH 无显著差异，表明大麦作为淀粉来源时，不同粉碎处理对育肥湖羊机体免疫功能没有显著影响。血液RBC 和HGB 可以作为判断机体是否贫血的指标［32］，反映动物机体血液运输氧气和二氧化碳的能力，PLT 的数量和功能与机体血液凝血系统相关，在维持血液循环中具有重要意义［33］。在本试验中，RBC、HGB 和PLT 均无显著差异，可知大麦淀粉来源的饲粮对湖羊机体的血液氧化还原能力和凝血功能影响不显著。冯跃进［34］指出血液RDW 可反映红细胞的变异程度，血液MCHC、MCH 和MCV 被称为判定贫血的3 项指标，较低的MCHC、MCH、MCV 和较高的RDW，可以鉴定为缺铁性贫血。本试验结果显示，饲粮处理不会使湖羊机体出现贫血症状。可见，饲粮大麦粉碎粒度对湖羊血常规指标无影响。

3.2 饲粮大麦粉碎处理对育肥湖羊瘤胃微生物区系的影响

大麦不同粒度的粉碎会改变谷物和瘤胃微生物及酶的接触面积，从而改变瘤胃可降解淀粉的含量，进而改变瘤胃发酵系统［11］，最终引起瘤胃微生物组成的变化，影响发酵速度和终产物的形成［35］。Plaizier 等［10］发现谷物粉碎处理饲喂奶牛诱导SARA 后，瘤胃pH 降低，瘤胃微生物中产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌等纤维分解菌的含量明显下降，相反，反刍兽新月形单胞菌和普雷沃氏菌等淀粉分解菌含量增加［36］。而在本试验中，4 mm 粉碎组的瘤胃微生物中产琥珀酸丝状杆菌和溶纤维丁酸弧菌含量增加，反刍兽新月形单胞菌的含量降低，这说明粗粉碎大麦可能会通过降低瘤胃可降解淀粉的含量而降低动物患SARA 的风险。Andrés 等［37］将玉米进行2 和6 mm 粉碎饲喂断奶羔羊，2 mm 粉碎组饲喂羔羊的瘤胃中普雷沃氏菌等淀粉分解菌含量增加。本试验2 和3 mm 粉碎组淀粉分解菌反刍兽新月形单胞菌数量增加与此一致。Carlson 等［38］研究发现，粒度的增加可能会延长营养物质崩解所需的时间，并延迟微生物接触可发酵有机物的时间，粒径的增加是降低发酵速率和瘤胃酸中毒风险的有效方法。本试验中，产琥珀酸丝状杆菌和溶纤维丁酸弧菌等纤维分解菌的数量在4 mm 粉碎组显著增加，这可能是因为4 mm 粉碎组中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）消化率显著高于其他处理［39］，促进了纤维分解菌的生长。

3.3 饲粮大麦粉碎处理对育肥湖羊肌肉脂肪酸的影响

本试验中，4 mm 粉碎组能够提高 C10：0、C12：0 和 C14：0 等偶数碳脂肪酸的含量。双金等［40］研究表明羊肉的膻味随体脂中C10：0 含量的增加而加重，因此4 mm 粉碎组可能会增加羊肉的膻味。有研究表明延长丙酸和戊酸碳链可以形成直链奇数碳脂肪酸，延长乙酸主要得到偶数碳脂肪酸［41］。而在本试验中，2、3 和4 mm 粉碎组乙酸含量分别为 49.72、49.58 和 54.47 mmol·L-1，各组间无显著差异［39］，4 mm 粉碎组仅在数值上有增长的趋势，具体原因有待进一步验证。瘤胃中生物氢化作用是产生CLA 的基础，而溶纤维丁酸弧菌是生物氢化的优势菌群，在本试验中4 mm 粉碎组的溶纤维丁酸弧菌数量显著增长，这可能促进了生物加氢，与Vlaeminck 等［42］的结果相似。动物采食谷物含量过高的饲粮会导致瘤胃氢化途径发生改变［43］，主要是改变了在瘤胃生物氢化过程中起关键作用的溶纤维丁酸弧菌数量，使饲粮 cis-9，cis-12 C18：2n-6 氢化生成 cis-9，trans-11 C18：2 和 trans-11 C18：1 途径转变成了生成trans-10，cis-12 C18：2 和trans-10 C18：1。这些结果说明瘤胃中纤维分解菌通过影响微生物氢化而改变瘤胃液及内容物中脂肪酸的组成，进而导致动物产品中脂肪酸组成发生变化［44］。亚麻酸和亚油酸等PUFA 不完全氢化可以合成 CLA［45］，在本试验中亚麻酸和亚油酸含量无显著差异，但 C16：1、C18：2n-9c11t 等 PUFA 的含量有增加的趋势，这也影响了CLA 的合成。

4 结论

在本试验条件下，大麦4 mm 粉碎组中纤维分解菌数量增加，反刍兽新月形单胞菌数量减少，肌肉脂肪酸中CLA 含量增加，因此，4 mm 粉碎处理大麦对湖羊瘤胃微生物区系和肌肉脂肪酸CLA 合成的影响效果最佳。