常压室温等离子体诱变选育抗后酸化的乳酸菌

2021-12-17周虹瑾霍向东赵丹林青娄恺袁华伟

食品与发酵工业 2021年23期

周虹瑾,霍向东,赵丹,林青,娄恺,袁华伟*

1(新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐,830000) 2(新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室,新疆乌鲁木齐,830091) 3(宜宾学院质量管理与检验检测学部/固态发酵资源利用四川省重点实验室,四川宜宾,644000)

酸乳在储藏、运输、销售和消费过程中,pH值会持续降低,出现酸味过重、乳清分离等一系列感官品质下降的问题,即后酸化现象[1],直接影响酸乳货架期及乳酸菌的活菌数量。

对于抗后酸化的研究,目前主要集中在改变加工工艺、基因工程技术及诱变育种3个方面。通过调整发酵酸乳中球菌与杆菌的比例(1.5∶1),能有效地减轻酸乳的后酸化,但易受到其他条件影响,效果不稳定[2]。巴氏杀菌或瞬时高温灭菌技术是以降低乳酸菌的活菌数(<106CFU/mL)为代价,抑制乳酸菌利用乳糖发酵产酸,极大地降低了酸乳的益生功能。研究人员利用载体 pGhost9:ISS1,经复制型转座构建保加利亚乳杆菌突变体,得到3株具有抗后酸化能力的保加利亚乳杆菌菌株[3-4],其生物学性状稳定,回复突变率低,但外源DNA转化困难且存在应用困境。

诱变育种是目前选育抗后酸化菌株最为有效的途径,包括物理诱变、化学诱变、原生质体融合等。韩雪等[5]采用紫外线对保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行诱变处理,得到低温敏感型突变菌株,能有效抑制酸乳的后酸化,但存在可见光修复问题,最适条件有待进一步研究。罗红霞等[6]对乳酸菌进行原生质体融合,利用青霉素进行筛选,获得2株在贮藏过程中后酸化程度明显减弱的菌株,但融合子的不稳定性、杂种细胞间的异源基因相互排斥等问题仍有待解决。利用新霉素对保加利亚乳杆菌进行诱变,可筛选出H+-ATPase弱化菌株,当酸度超过阈值时,乳酸菌产酸能力显著下降[7]。此外,将紫外线诱变和1.5%硫酸二乙酯复合诱变结合,突变菌株能抗酸乳后酸化[8]。

研究认为,H+-ATP酶活性与转运H+能力有关,H+-ATPase弱化菌株的本质是酸敏菌株[7],即在正常的酸度下H+-ATPase正常行使其功能,保持乳酸菌的耐酸性；当酸度超过阈值时H+-ATPase酶活性显著弱化,乳酸菌产酸能力则显著下降。

本研究采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)[9]对菌株进行诱变处理,结合新霉素筛选得到低H+-ATP酶活性突变株,测定突变菌生长特性并进行酸奶发酵实验,以期得到具有抗后酸化能力的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei) B15由新疆特殊环境微生物实验室分离、鉴定及保藏。

1.1.2 试剂与培养基

新霉素、PCR Master Mix扩增试剂盒、Bradford蛋白检测试剂盒、溶菌酶、Na2ATP、HCl、钼酸铵、H2SO4、甲苯、Na2SO3、对甲基氨基苯酚,生工生物工程(上海)股份有限公司；MRS琼脂、MRS肉汤,青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

ARTP-II诱变系统,无锡源清天木生物科技有限公司；电热恒温培养箱,上海一恒科学仪器有限公司；PCR仪,美国Bio-Rad；pH计,德国Sartoris；Fresco17离心机,Thermo Fisher Scientific Inc.；电泳仪、凝胶成像系统,北京六一生物科技有限公司；分光光度计,上海科华生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 ARTP诱变

将L.paracaseiB15接种至MRS肉汤中进行活化与扩大培养,离心收集对数生长期的菌体,根据已有研究[10-11],将菌体稀释为5×106CFU/mL后进行ARTP诱变。将10 μL菌悬液均匀涂布于金属板上,放置在ARTP诱变系统样品处理室,与气流端口间距调整到2 mm[12]。ARTP的工作参数如下：射频功率输入100 W；工作气体纯氦的流量10 L/min[13]。在控制上述条件的情况下,设置对照组,将涂有菌悬液的金属板以不同处理时间(0、10、15、20、30、45、60、90 s)暴露在处理端口下。结束诱变后,用无菌生理盐水洗脱样品,再以梯度稀释方法将不同浓度的悬液涂布于MRS琼脂平板上,从而测定ARTP诱变剂量。对照组和实验组均将在37 ℃培养48 h,致死率按公式(1)计算:

(1)

式中：S,对照培养基上的单菌落数；M,每个处理组培养基上的菌落数,单位均为菌落形成单位(colony formal units,CFUs)[14]。

1.3.2 突变菌株的筛选

选择85%致死率对应的时间(30 s)作为ARTP诱变处理时间[15],将处理后的菌株同样使用梯度稀释法进行稀释。将稀释后的悬液(100 μL)涂布在添加了不同质量浓度新霉素(100、200、300、400、500 mg/L)MRS琼脂平板上,而未添加新霉素MRS琼脂平板则作为空白对照。在相同条件下(37 ℃,48 h)培养,记录单菌落数,阳性筛选率按公式(2)计算:

(2)

式中：S′,不含新霉素的对照组MRS琼脂平板菌落计数；M′,不同浓度新霉素MRS琼脂平板单菌落数。

选择阳性筛选率50%以上的平板所对应的新霉素浓度作为突变菌株的筛选条件,将从MRS琼脂平板上获得的突变菌株接种于MRS肉汤(3 mL)中,进行下一步的筛选和验证。通过筛选获得的菌株在-80 ℃超低温冰箱进行保存。

1.3.3 初步筛选具有抗后酸化潜力的突变株

1.3.3.1 生长状况和pH值测定

将筛选得到的突变株和对照组均接种于同样培养条件下的MRS肉汤中,接种量3%,37 ℃培养24 h,每隔2 h取样1次,测定OD660 nm与pH值的变化。

1.3.3.2 H+-ATP酶的提取与活性测定

将对照组与突变株均接种到MRS肉汤(3 mL)中进行活化,37 ℃下培养48 h,将菌液(10 mL)离心(8 000 r/min,10 min,4 ℃)后弃上清液,加入50 μL甲苯和500 μL含10 mmol/L MgSO4溶液的Tris-HCl缓冲液,37 ℃静置5 min后在-80 ℃冷冻2 h。重复完成冻融操作后9 000 r/min离心10 min,重悬溶液后再次加入400 μL Tris-HCl缓冲液[16]。

按照H+-ATP酶活性检测试剂盒测定方法,将50 μL Na2ATP(0.1 mol/L)加入酶提取液中开始反应,37 ℃条件下,静置20 min,加入600 μL HCl(0.1 mol/L)终止反应。将溶液置于冰浴中进行冷却,离心(6 000 r/min,4 ℃,10 min)后收集上清液。加入2.0 mL着色剂30 min后测定OD660 nm,得到磷含量[17]。本实验中蛋白定量测定采用Bradford蛋白检测试剂盒进行检测。H+-ATP酶活性以U/mg表示,即每个活性单位U定义为1 mg H+-ATP酶粗提物在1 min内将ATP分解成1 mol无机磷酸盐[18-19]。

1.3.4 突变株的抗后酸化特性验证

将筛选得到的具有抗后酸化潜力的突变株活化后接种于MRS肉汤(3 mL)中,37 ℃培养24 h。将1 mL菌液接种于相同条件下的MRS肉汤(300 mL)中,扩增培养48 h。取30 mL培养液,5 000 r/min离心10 min后弃上清液,重悬于30 mL磷酸缓冲溶液(PBS,pH 7.4)。菌体和PBS以1∶1的比例制备菌悬液,放入4 ℃环境下进行保存。

全脂牛奶(100 mL)在42 ℃下预热,加入制备好的菌悬液(5×106CFU/mL)进行接种,搅拌均匀后42 ℃培养至完全凝乳。发酵完成后4 ℃进行贮藏。

测定发酵0、1、5、10、15、20 d的发酵乳pH值和酸度的变化[20]。pH的变化将直接使用精密pH计(±0.01)在室温条件下进行测定。酸度则选择国标法(GB 5009.239—2016)进行检测：将10.0 g的发酵乳样品与20.0 mL蒸馏水和2.0 mL的酚酞乙醇(0.5%)混合均匀,使用NaOH(0.100 mol/L)标准溶液进行滴定,指示反应终点为微红并30 s内不褪色[21]。记录整个反应过程中NaOH标准滴定液的消耗量(mL)。发酵乳的酸度计算如公式(3)所示:

(3)

式中：c,NaOH标准溶液浓度,mol/L；V1,滴定过程中消耗的NaOH标准溶液的体积,mL；V0,空白实验所消耗NaOH标准溶液的体积,mL；m,发酵乳样品的质量,g。常数0.1为酸度理论定义的NaOH摩尔浓度,单位为mol/L[22-23],即滴定酸度(°T)为发酵牛奶消耗的0.100 mol/L NaOH标准溶液的体积。

1.3.5 突变株遗传稳定性

将突变株接种至MRS肉汤(5 mL)中,于37 ℃下培养18 h进行活化。将活化菌株在MRS肉汤中连续传代9次,37 ℃下培养24 h。12 ℃下储藏6 d,检测pH值和酸度两项指标的变化以确定突变株是否具有遗传稳定性。

2 结果与分析

2.1 ARTP诱变处理时间的确定

根据ARTP诱变的操作原理,处理时间是达到剂量依赖性致死率的关键因素[24]。L.paracaseiB15致死率如图1所示,当辐照时间达到45 s时,菌株的致死率为96%；当ARTP诱变时间延长至60 s以上后,细胞的致死率约为99%。

图1 L.paracasei B15在ARTP不同处理时间下的致死率Fig.1 Lethality rate of L.paracasei B15 under different mutagenic time of atmospheric and room temperature plasma treatment(ARTP)

根据已有的研究,当ARTP诱变的致死率在90%左右时,阳性诱变率较之其他致死率对应的处理时间下明显更高[25-26]。因此,选择87%致死率对应的30 s作为ARTP诱变的最佳处理时间。

2.2 抗后酸化突变菌株的筛选

2.2.1 新霉素筛选突变菌株

基于新霉素对高H+-ATP酶活性菌株的抑制作用,本实验将不同浓度的新霉素溶液加入MRS琼脂平板作为选择培养基。将可在平板上生长的菌株记录为阳性菌株,通过设置不添加新霉素的空白对照组进行阳性筛选和概率计算。当新霉素质量浓度为300 mg/L时,阳性率最高可达62%(图2)。以往的研究表明,联合诱变处理的突变率和阳性突变率高于单处理诱变[27]。因此,在ARTP诱变的基础上,向MRS琼脂平板中添加300 mg/L新霉素可以认定是筛选H+-ATP酶活性较低的突变菌株的合适方法。

图2 不同浓度新霉素下阳性突变株筛选率Fig.2 Effects of mutagenesis on positive survival rate in candidate strains with different concentration of neomycin

2.2.2 抗后酸化突变菌株生长特性和H+-ATP酶活性

通过ARTP诱变结合300 mg/L新霉素筛选,共获得7株突变株,其对数生长期均出现在培养8 h后,晚于对照组2 h左右(图3)。突变株BJT-5、BJT-6和BJT-7的生长速率明显降低,稳定期的生物量是其他菌株的1/2左右。

图3 B15及突变株的生长曲线Fig.3 Growth curves of B15 and mutants during culture period

突变菌株培养8 h后,培养基pH值出现快速下降(图4),与图3中菌株对数生长期的时间一致,即菌体的代谢旺盛时期,代谢产物产物的迅速积累造成pH值的快速下降。突变株BJT-7在培养10 h后,pH值趋于稳定,最低为4.74,pH值变化最小,有较强的抗后酸化能力。

图4 B15及突变株在培养阶段pH的变化Fig.4 pH of B15 and the mutants during culture period

如图5所示,突变菌株的H+-ATP酶活性均低于对照组的原始菌株。突变菌株BJT-7的H+-ATP酶活性最低,为0.57 U/mg,对照组原始菌株的H+-ATP酶活性是BJT-7的3.09倍。由此推测,菌株生长能力可能与H+-ATP酶活性有关,突变株H+-ATP酶活性的降低,降低了菌株底物的磷酸化水平,导致ATP产量下降,生长速率降低,产酸能力降低,这与已有研究结果一致[28]。结果表明,ARTP联合新霉素的筛选方法能够有效筛选出H+-ATP酶活性较低的菌株。

图5 突变株与B15的H+-ATP酶活性Fig.5 The H+-ATPase activity of the mutants and B15

2.3 突变菌株抗后酸化能力的验证

在全脂牛乳中接种菌悬液进行发酵(37 ℃,48 h),待完全凝乳后测定4 ℃冷藏下发酵乳的pH值及酸度。图6表明,各突变株处理组1 d内pH变化均不明显,对照组稍有下降。

图6 发酵乳pH变化曲线Fig.6 pH of fermented milk during storage

1～10 d,均为各处理pH值下降最快的时期,其中对照组变化幅度达到0.67,BJT-7变化幅度最小,为0.23。20 d时,对照组pH最低,为3.79,BJT-7的pH值最高,为4.27。

由图7可知,对照组的酸度在储存期间始终在上升,至20 d达到88 °T左右。突变株BJT-5和BJT-6在0～5 d期间酸度变化较小,5～10 d出现酸度增长的对数期,但后续酸度增加趋缓。突变株BJT-7在整个存储过程中酸度变化幅度最小,20 d时酸度为73 °T。随着各处理组pH值的下降,其酸度相应上升。