细胞永生化技术研究进展

刘育昆 邹登朗 祁得胜 刘忠浩 都玉蓉 马建滨

(青海师范大学生命科学学院，青海省青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室，西宁，810008)

细胞永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。而永生化自发发生的概率极低，啮齿类动物自发性永生化自发发生的概率为10-6—10-5，而人类细胞永生化自发发生的概率则小于10-12[1]。正常情况下在体外条件下培育的细胞可以产生有限次数的增殖以及传代，但经过有限次数增殖和传代后，细胞就会停止增殖并发生衰老灭亡，这种情况限制了有关细胞培养实验的继续进行，研究者通过基因转染等技术将外源性永生化基因导入目的细胞中，使永生化基因在靶细胞基因组中整合并表达，建立永生化细胞系。目前研究显示端粒的长度以及端粒酶的活性与细胞永生化的关联较密切。研究者对细胞永生化发生机制的研究获得了较大进展，本文在细胞永生化基本原理的基础上，对细胞永生化方法进行概述。

1 细胞永生化原理

人的正常细胞在体外培养并分裂一段时间后会进入衰老期(M1期)。除干细胞、生殖细胞外，大部分真核生物细胞都具有该特性。例如人上皮细胞在分裂40至60代后就会停止生长，产生DNA合成蛋白抑制因子，保证DNA复制和染色体分配质量的检查机制就会发送细胞周期停止信号，阻止DNA合成，细胞不再分裂并开始衰老，而病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等则可越过衰老期而进入增长抑制状态，即危机期(M2期)。细胞在该周期中会逐渐出现退化、死亡的现象；只有罕见的细胞在某些因素的作用下可以激活端粒酶。为了补充或延长端粒，维持端粒长度，这些细胞以自身RNA为模板合成端粒DNA，从而维持染色体的稳定性，使细胞可以顺利跳过M2期，从而获得无限分裂增殖的能力，最终发生细胞永生化[2]。

2 促细胞永生化的几种方法

2.1 筛选自发突变产生的永生化细胞

这种永生化细胞是在培养期间发生基因突变引起的，这些细胞逾越复制以及衰老的原理尚不清楚，且基因型不稳定，较易丢失有关来源组织的细胞特性。该方法大部分应用于啮齿类动物细胞的永生化[3]。

2.2 化学致癌物以及射线因素产生细胞永生化

通过电离辐射、X射线、核辐射、60Co等照射处理细胞，使细胞通过射线照射诱导发生永生化。由于放射性元素破坏了细胞稳定性，使染色体重组，抑制抑癌基因的表达，促进与细胞周期延长有关基因的表达，从而维持端粒长度，使细胞老化过程不能正常进行，因此细胞将无限增殖[4]。1997年O’Reilly等[5]通过紫外灯照射2个人类皮肤角质细胞系后发现紫外灯照射能增加这2个细胞系的存活寿命。使用化学致癌物方法使细胞永生化的原理与射线因素产生细胞永生化的原理相同，但是这两种方法都会使基因组产生部分随机损伤，所以随着技术的先进化，这两种方法已经不再常见。

2.3 病毒感染诱导细胞永生化

将病毒通过转化感染到正常细胞中，可以改变基因，使部分细胞成功渡过两个致死期，得到无限增殖的能力，从而诱导细胞永生化[6]。病毒感染诱导细胞永生化是将整个病毒基因组导入细胞，这样会改变细胞表型，应用于病毒的特定宿主细胞且容易使细胞转化为肿瘤细胞。例如人乳头状瘤病毒、EB病毒、猴肾病毒SV40。

2.3.1 人乳头状瘤病毒(HPV)

人乳头状瘤病毒(human papilloma virus)是一种对上皮细胞具有高度特异性的DNA肿瘤病毒，该病毒会引起细胞增殖，将正常细胞转化成乳头状瘤细胞。人乳头状瘤病毒的永生化率可达10-5[7]。德国科学家Harald zur Hausen 获得2008年诺贝尔生理学奖，证实了HPV病毒可诱导病发宫颈癌。在HPV编码基因中，占基因组50%的早期区表达蛋白含有E1—E8 8个阅读区，其中E6和E7两个阅读区编码相应蛋白，可以改变细胞的末期分化，使细胞逾越保证DNA复制和染色体分配质量的检查机制，从而使细胞永生化。所以E6和E7两个阅读区在细胞永生化中起到了关键作用。有实验表明被HPV感染的上皮细胞内端粒的长度停止缩短并不断增长，使细胞达到永生化[8]。

2.3.2 EB病毒

EBV是疱疹病毒(Epstein-Barr virus)，EBV在体外能和培养的B淋巴细胞融合，进而感染B淋巴细胞，使基因通过显性表达改变细胞周期[9]，使其正常细胞形成永生化的淋巴细胞系。研究发现EBV永生化B细胞的过程主要有6种病毒基因表达：EBV核抗原1(EBNA1)、核抗原2(EBNA2)、核抗原3A(EBNA3A)、核抗原3C(EBNA3C)、核抗原LP(EBNA-LP)以及潜伏膜蛋白1(LMP1)[10]。EBNA1在病毒的潜伏期和裂解周期都有表达，在病毒的复制和分离中起着重要作用，EBNA1是一种序列特异性DNA结合蛋白，能帮助病毒基因与细胞有丝分裂染色体结合[11-12]，Mühe等[13]发现EBNA2通过一个结构域传递信号以启动B细胞永生化，然后利用单独的结构域维持永生化B细胞生长，并且EBNA2能与EBNA-LP相互作用，共同激活[14]。B细胞进行体外转化时，EBNA3A、EBNA3C、LMP-1起到了至关作用。EBV癌蛋白LMP-1组成型激活NF-κB，促进转化细胞增殖并抑制凋亡，对EBV永生化B细胞的存活至关重要[15]。

研究发现，被EB病毒感染的淋巴细胞内抑癌基因的转录表达水平有所上升，但是细胞寿命并未缩短，这个发现证明了EB病毒可以抑制抑癌基因活性，具有永生化淋巴细胞的能力[16]，EB病毒永生化的B淋巴细胞的最显著特点是提高端粒酶活性，提高端粒酶活性可能是B淋巴细胞永生化的关键原因，当前研究中应用EB病毒感染细胞使细胞永生化最多的是B淋巴细胞，在其他细胞永生化中的应用不多[17]。

2.3.3 猴肾病毒(SV40)

猿猴病毒SV40是由LT和st两种抗原及相关蛋白组成的简单的真核细胞病毒，由于猿猴病毒SV40对细胞生长、转化、瘤化的高效性，现在已应用于真核细胞生物工程实验[18]。1989年Shay等研究表明，通常情况下，猿猴病毒转染细胞时发生永生化的概率极低；SV40诱导细胞永生化涉及很多因素，其中LT片段起了决定性作用前对SV40转染细胞发生永生化的具体机制尚未明确[17]。1997年Srinivasan等[19]研究猜测将SV40的T抗原片段整合到靶细胞核内进行表达，从而诱导细胞永生化，这可能是因为T抗原片段与pRB-E2F复合体结合，使E2F从pRB-LT复合体中分离出来，抑制细胞衰老，从而达到细胞永生化。2019年生立平等[20]证实SV40T能够独自使施旺细胞(SCs)启动重编程，使SCs转化为间充质干细胞。目前，研究者发现了很多将正常细胞通过SV40转染成永生细胞株的方法，其中共培养野生型SV40病毒法感染靶细胞、磷酸钙法、电穿孔以及逆转录病毒载体法等效果显著[17]。

2.4 端粒-端粒酶激活诱导细胞永生化

端粒具有独特的帽状结构，它们存在于真核细胞染色体的头端和尾端，由DNA序列和蛋白质构成。端粒长度约为5—15 kb，担负重要的生理功能，包括维持染色体结构和位置的稳定性，防止化学酶降解染色体，调节细胞正常功能，决定细胞寿命等[21]。端粒长度与有丝分裂次数有关。体外培养的细胞分裂1次，端粒就会缩短50—200 bp[22]。所以端粒被称为细胞寿命的“有丝分裂钟”。而端粒酶是一种催化端粒自我复制并负责端粒的延长的逆转录酶。它也是调节细胞周期的重要生物因子。它的功能是通过转录自身的RNA序列形成一个新的端粒DNA序列，用来补充缺少的端粒，保持端粒的长度和细胞的无限分裂[17]。端粒酶是细胞永生化的关键。一般情况下，大部分的体细胞端粒酶在表达时是严格调控的，同时表达是低水平和瞬时的[23]。但在细胞永生化之后，其端粒酶的活性会明显增强。研究发现，hTERT作为端粒酶的催化亚单位，与相关蛋白结合后可以激活端粒酶，延长体外细胞培养的生命周期[24]。它是端粒酶的正向调节因子[25-27]。利用端粒-端粒酶激活诱导细胞永生化是当前细胞永生化最有效的方法，应用最多的方法。但是该方法可以使大多数人类或动物细胞永生化，但是对于某些细胞来说，只凭借该方法不足以使细胞永生化，还需要其他方法辅助进行。

2.5 可回复性永生化

可回复性永生化的基本原理是将筛选的永生化基因导入至原代细胞，从而使原代细胞转化为具有体外增殖能力的永生化细胞株，然后通过特异性位点重组技术切除永生化基因，使细胞株回复到初始原代细胞的状态[28-32]，近年来出现的可回复性永生化技术将条件基因敲除技术Cre/Loxp系统与基因转染技术相结合，诱导细胞永生化，提高细胞增殖能力，在扩增培养获得足够数量的永生化细胞后，利用位点特异性酶对基因组中的永生化基因进行再切除，实现了细胞永生化和可控回复性[33]。例如研究肝脏疾病首先需要理想的永生化肝细胞株，而传统肝细胞株存在安全性及特异性功能分化较差的缺点，该方法为获得理想肝细胞提供了新思路[27，34-35]。这样不但克服了肝细胞的体外增殖，而且避免了安全性及功能分化差的缺点[36]。

各种细胞永生化方法比较如表1，通过表1可以看出自发突变以及化学致癌物、射线诱导细胞永生化缺点多、效果差，随着科技的进步，已经逐渐被新技术取代。病毒感染诱导细胞永生化目前应用最广，但普遍存在安全性及特异性功能分化较差、理想永生化少、针对性较强等缺点，且永生化基因长期存留在细胞内具有潜在的恶变风险。可回复性永生化既能使细胞无限增殖，又克服了细胞因永生化而发生恶性转变、安全性差的缺点，但目前该方法只在肝细胞永生化上应用最多。而端粒-端粒酶激活诱导细胞永生化可使大多数人类或动物细胞永生化，且建立的永生化细胞可保持正常细胞的生理特性，但对于某些细胞来说，只凭借该方法不足以使细胞永生化，还需要其他方法辅助进行，利用端粒-端粒酶激活诱导细胞永生化是当前细胞永生化最有效的方法。

3 永生化细胞检测方法

体外培养的永生化细胞除了具有无限增殖传代的功能以外，其他细胞特性并未发生变化。目前对永生化细胞的鉴定方法如下。

3.1 检测永生化细胞外源基因的整合与表达

运用DNA免疫印迹法检测永生化细胞外源基因的整合与表达[14]，Southern-blot检验外源基因在基因组中的整合情况，Northern-blot检验外源基因是否能正常表达，如果可以正常表达，则会生成特异mRNA。Western-blot分析外源基因是否可以正常表达蛋白质。鉴定某些与该外源基因有关的基因来判断该外源基因是否具有原有的细胞特性。

3.2 端粒酶活性的检验

具有较高端粒酶活性是永生化细胞的另一特点，通过检验端粒酶活性，可以对永生化细胞进行鉴定。以人外源端粒酶逆转录酶(hTERT)为例，运用PCR可以检测hTERT基因整合，RT-PCR检测hTERTmRNA表达，运用免疫细胞化学检测外源hTERT蛋白质表达，可见hMSC-hTERT细胞核中存在大量黄褐色颗粒，hTERT表达呈阳性，而hMSC中hTERT表达呈阴性，证明外源hTERT已经整合到hMSC中，并可以稳定表达蛋白质[37]。

3.3 永生化细胞表面抗原的检测

因其永生化细胞本有的细胞特性并未发生变化，所以永生化细胞仍有其特异的表面抗原标记，可用流式细胞术和免疫荧光技术对永生化细胞的表面抗原进行检测。

3.4 永生化细胞功能的检测

诱导具有分化潜能的细胞体外分化，观察其分化能力。之后通过上述方法检测永生细胞是否具有与体内原始细胞同样的功能，另外，永生细胞不同于癌细胞，它不致癌，皮下注射可以用来检测获得的永生细胞是否致癌[17]。

4 结语与展望

细胞永生化是研究细胞增殖分化的理想模型，我们可以利用细胞永生化的各类方法使那些增殖分化困难易衰老的细胞获得永生，从而为研究者提供更多的细胞资源。但目前仍有很多问题没有解决，如虽然到目前为止细胞永生化的方法有很多，但是不同的细胞运用哪种永生化方法最有效没有明确，细胞具体的衰老机制尚未摸清等。这些尚未解决的难题，在未来有必要开展特定的细胞研究，阐明每一种细胞不同的分子机制，这对于为生物实验研究提供有力工具，为有效准确地诊断疾病提供新道路，有着不可或缺的作用，总之细胞永生化的应用前景广阔，精确有效细胞永生化技术的建立对生物学、再生医学、组织工程等学科的发展意义重大。